基因敲除實驗指南(原著第二版)(導讀版)（簡體書）

小鼠和人類基因組測序完成後，哺乳動物基因的功能鑒定及其分子互作網絡的闡明成為生命科學研究的下一個主要任務，小鼠基因組為這些研究提供了方便且重要的模型。《實驗室解決方案：基因敲除實驗指南（原著第2版）（導讀版）》的多位撰稿人在基因打靶和小鼠遺傳學領域有著豐富的研究經驗，他們全面介紹了分步驟的實驗方案。除了著重闡述近幾年發展起來的多種基因突變技術，還涉及胚胎幹細胞的基因修飾、幹細胞操作、基因工程小鼠的製備和突變型分析等。《實驗室解決方案：基因敲除實驗指南（原著第2版）（導讀版）》秉承Sprjnger《分子生物學方法》系列叢書的一貫風格，闡述明晰、便於使用，各章包括，必備材料與試劑的清單，易於操作的實驗室方案、疑難問題的注意事項和易犯失誤的避免。本書第二版全面更新、專業權威，由經驗豐富的研究者提供了切實可行的實驗方案，對本領域的初涉者和遺傳學領域的研究人員而言是一本極具價值的參考書。·

《基因敲除實驗指南(原著第2版)(導讀版)》各章均包含針對標題的導言、必備材料與試劑的清單、易于操作的實驗室方案、疑難問題的注意事項和易犯失誤的避免。《基因敲除實驗指南(原著第2版)(導讀版)》第二版全面更新、專業權威，由經驗豐富的研究者提供了切實可行的實驗方案，對本領域的初涉者和遺傳學領域的研究人員而言是一本極具價值的參考書。

前言
撰稿人
1．突變小鼠綜述
第一部分：胚胎幹細胞中的基因修飾
2．利用同源重組進行基因打靶載體的構建
3．基因捕獲載體和誘變作用
4．在胚胎幹細胞中的染色體工程技術
5．通過寡核苷酸單鏈DNA在胚胎幹細胞的基因修飾
6．shRNA轉基因小鼠的製備
7．利用甲基磺酸乙酯對小鼠胚胎幹細胞的誘變

第二部分：幹細胞操作
8．小鼠胚胎幹細胞的基因打靶
9．小鼠胚胎幹細胞的操作
10．胚胎幹細胞流程的建立
11．雙基因敲除胚胎幹細胞的製備
12．體外小鼠胚胎幹細胞全能性差異分析
13．胚胎幹細胞克隆及小鼠核移植

第三部分：小鼠遺傳工程
14．小鼠囊胚的分離，顯微注射及移植
15．嵌合體的聚集：包括胚胎幹細胞，二倍體，四倍體胚胎
16．利用八細胞胚胎幹細胞顯微注射獲得全能胚胎幹細胞F0代小鼠
17．利用細菌人工染色體進行Cre重組表達轉基因小鼠的製備
18．誘導小鼠
19．建立和應用Cre重組酶轉基因數據庫
20．在小鼠中進行轉座子誘變
21．慢病毒轉基因技術
22．精子冷凍保存和體外受精

第四部分：表型分析
23．在轉基因小鼠的表型中遺傳背景的影響
24．突變小鼠的病理表型
25．首要系統表型
索引·

1.Prepare 96-well flat-bottom TC plates with MMC-treated MEFs the day before picking the ICMs.
2.Draw out bend capillaries(~45°)from glass micropipettes in a gas flame(two for each ICM),break them by hand: capillaries with a tip size of~200 μm are used to pick and transfer the ICM outgrowth,a tip size of <50 μm(half="" icm="" diameter)is="" suitable="" for="" icm="" dissociation;="" store="" capillaries="" in="" sterile="" dishes.="">
3.Prepare a 96-well round-bottom TC plate containing 30 μL/well 0.25％ Trypsin-EDTA for each ICM harvested.
4.Aspirate medium from 12-well TC plate containing blastocyst outgrowths,wash once with trypsin,aspirate trypsin immediately.
5.Place 12-well plate under a dissecting microscope placed within a clean bench.Using the 200-μm capillaries fitted with the mouth-controlled aspirator tube assembly,detach ICM from feeder layer and transfer each into an individual well of the trypsin containing 96-well round-bottom TC plate.Try to work fast; otherwise,the wells will dry out.
6.Incubate 5-10 min at 37℃,7.5％ CO2.
7.Dissociate the ICM under the dissecting microscope using a mouth-controlled 50-μm capillary,by repeated pipetting in and out until single cells are obtained(see Note 9).
8.Upon dissociation of ICMs transfer suspended cells with the same capillary into a well of a 96-well TC feeder plate,prefilled with 180 μL ES medium.
9.Let cells grow for 2-4 days.Replace medium after 2 days with fresh ES medium.
10.Carefully inspect the wells at day 2 after ICM dissociation under low(50X)and high power(200X)magnification for the presence of colonies that exhibit ESC morphology(group of small cells in close contact forming a colony with clear borderline).Colonies may be marked with a pen at the bottom of the plate and reinspected the next day.A positive well usually exhibits several(2-10)ES colonies(see Note 10).Passage 1: Label positive wells with ES line name and passage no.1; prepare MEFs for splitting and expansion of the cultures.