細胞生物學實驗（簡體書）

肖義軍、張彥定主編的《細胞生物學實驗》內容介紹：本書內容主要包括基礎性實驗和綜合性實驗兩部分。基礎性實驗包括各種顯微鏡的使用、細胞形態和結構的觀察、細胞化學、細胞膜生理、細胞分裂、細胞培養、生物大分子的原位檢測、細胞的分選和分析及細胞凋亡的檢測共9章36個實驗，這里面既有傳統的細胞生物學經典實驗，也有現代細胞生物學研究的新技術、新方法，是最能代表本學科特點的實驗方法和技術。

前言

第1部分 基礎性實驗
第一章 顯微鏡技術
實驗1 普通光學顯微鏡及其使用
實驗2 光學顯微鏡標本的制作技術及HE染色
實驗3 特殊顯微鏡的原理和使用
實驗4 激光掃描共焦顯微鏡的原理與使用
實驗5 透射電鏡的原理與使用
實驗6 掃描電鏡的原理與使用

第二章 細胞形態與結構的觀察
實驗7 不同細胞形態的觀測及大小的測量
實驗8 線粒體和液泡系的活體染色與觀察
實驗9 葉綠體的分離純化與熒光觀察
實驗10 考馬斯亮藍染色顯示植物細胞骨架及其光鏡觀察
實驗11 間接免疫熒光標記法顯示動物細胞中的微管

第三章 細胞化學
實驗12 甲基綠-派洛寧染色顯示DNA和RNA在細胞中的分布
實驗13 Feulgen反應顯示細胞中DNA的分布
實驗14 PAS反應顯示細胞中糖原的分布
實驗15 脂類的細胞化學
實驗16 酶的細胞化學——酸性磷酸酶的顯示

第四章 細胞膜生理
實驗17 活細胞與死細胞的鑒定
實驗18 細胞膜的通透性
實驗19 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬現象的觀察
實驗20 植物凝集素對紅細胞的凝集作用

第五章 細胞分裂及染色體標本的制備
實驗21 有絲分裂
實驗22 減數分裂
實驗23 植物根尖染色體標本制備

第六章 細胞培養
實驗24 動物細胞原代培養
實驗25 動物細胞傳代培養
實驗26 動物細胞凍存與復蘇
實驗27 植物細胞懸浮培養

第七章 核酸、蛋白質的原位檢測
實驗28 原位雜交
實驗29 免疫組織與細胞化學技術

第八章 細胞的分選與分析——流式細胞技術
實驗30 流式細胞儀測定細胞周期

第九章 細胞凋亡的檢測
實驗31 細胞凋亡的形態學觀察
實驗32 凋亡細胞的瓊脂糖凝膠電泳檢測——DNA ladder
實驗33 凋亡細胞原位末端標記法檢測——TUNEL
實驗34 流式細胞儀檢測細胞凋亡
實驗35 線粒體膜電位檢測細胞凋亡
實驗36 caspase-3活性測定檢測細胞凋亡

第2部分 綜合性實驗
實驗37 低溫誘導植物根尖細胞染色體數目加倍
實驗38 動物細胞融合（PEG介導的雞血細胞融合）
實驗39 動物骨髓細胞染色體標本制作
實驗40 抑制腫瘤細胞增殖有效成分的篩選
實驗41 植物原生質體分離、融合與培養
實驗42 增殖細胞核抗原（PCNA）與海洋浮游植物生長之間的關系

主要參考文獻

第1 部分 基礎性實驗
第一章 顯微鏡技術
顯微鏡是觀察細胞形態結構的基本工具，有了光學顯微鏡的發明才有細胞的發現，有了石蠟切片技術和各種染色技術的發明才使得對細胞的內部結構有了一定的認識，電子顯微鏡的發明和超薄切片技術的出現則加深了人們對細胞細微結構的了解。相差顯微鏡、微分干涉顯微鏡和顯微操作儀的發明使得對活細胞的觀察及外科手術操作變為可能。熒光顯微鏡在核酸和蛋白質等生物大分子的定位與定性研究方面發揮了重大作用。激光掃描共焦顯微鏡使得觀察活細胞內各種細胞器和生物大分子的動態結構及活動成為可能。
顯微鏡是細胞生物學研究中最基本的實驗工具。掌握顯微鏡的調試和使用的基本技能，了解各種不同的光學顯微鏡及電子顯微鏡的基本原理、特點和應用范圍，對于細胞生物學的學習和研究是十分必要的。
實驗1 普通光學顯微鏡及其使用
【實驗目的】
1. 了解普通光學顯微鏡的構造、基本原理、保養方法，掌握光學顯微鏡的使用方法。
2. 熟悉光鏡下細胞的基本形態和結構。
【實驗原理】光學顯微鏡由光學放大系統和機械裝置兩部分組成。光學系統一般包括目鏡、物鏡、聚光鏡、光源等；機械系統一般包括鏡筒、物鏡轉換器、鏡臺、鏡臂和底座等。標本的放大主要由物鏡完成，聚光鏡能使光線照射標本后進入物鏡，形成一個大角度的錐形光柱。物鏡上方形成一個倒立的放大實像，目鏡將此倒像進一步放大成像于人的視網膜上，形成一個正立的實像。判斷顯微鏡性能最重要的指標是分辨率，它主要由物鏡決定，實際使用中也與聚光鏡相關。
分辨率可用下式表示：R=0.61λ/NA，R值越小，分辨率越大。λ為入射光的波長，NA為物鏡的數值孔徑。NA=n?sin（α/2），n為介質的折射率，α為鏡口角的大小。
【實驗用品】
1. 實驗器具普通光學顯微鏡。
2. 實驗試劑香柏油、鏡頭清洗液（乙醚∶無水乙醇=7∶3，或二甲苯）。
3. 實驗材料各種動植物組織細胞或微生物永久裝片或臨時裝片。
【方法與步驟】
1. 普通光學顯微鏡的基本構造
普通光學顯微鏡的構造主要分為三部分：機械部分、照明部分和光學部分，詳見圖1-1。
2. 顯微鏡的使用方法
（1）聚光鏡的使用方法聚光鏡是光學顯微鏡照明光路中的重要部件，聚光鏡沒有調整好會影響顯微鏡的實際分辨率，也使視野中因雜散光的存在而產生暈光。
1）聚光鏡的對中①調出清晰的多邊形：將視場光圈和孔徑光圈調到最小的狀態，若顯微鏡的狀態正確，此時在視野中可以看到一個邊緣清楚的多邊形。否則，應轉動聚光鏡的上下調節旋鈕，使聚光鏡緩慢上升或下降，使得視場中形成一個邊緣清晰的多邊形。
注意：不要經常調節聚光鏡高度。調節好高度后，以后都不要再移動其高低位置。顯微鏡安裝好后，一般都已經調節好高度，所以可以直接進行下一步調節（如果找不到多邊形，可將視場光圈稍微放大，視野稍亮就可以找到）。
②多邊形調到正中心：視野中多邊形的正確位置應該是在視野的正中心，如果不在說明光路有偏移，需要調節聚光鏡對中螺釘，使多邊形位于視野的中心。
③多邊形調成外切：將視場光圈慢慢放大，當多邊形正好外切于視場時就是視場光圈的最佳工作位置。此時，聚光鏡的光軸與照明光路及成像光路的光軸合軸。調節好后，日常使用中不要隨意調整對中螺絲桿。
2）孔徑光圈的調節：一般顯微鏡的聚光鏡外側邊緣上均具有刻數及定位記號，便于調節聚光鏡與物鏡的數值孔徑使其相匹配，以取得最佳的分辨率。低數值孔徑的物鏡要配合低數值孔徑的聚光鏡；反之，高數值孔徑的油鏡要配合高數值孔徑的聚光鏡。若聚光鏡外側沒有標刻數字，則先將物鏡聚焦，再取出一個目鏡，眼睛往鏡筒內看，可見物鏡后透鏡呈一明亮的圓，若看不見孔徑光圈的輪廓像，說明孔徑過大；若僅是一個很小的明亮輪廓像，則說明孔徑過小。
當緩慢增大孔徑剛好使物鏡后透鏡呈一明亮圓時，則聚光鏡與該物鏡的數值孔徑已相互匹配。
（2）低倍鏡的使用方法
1）取鏡和放置：顯微鏡平時存放在柜或箱中，用時從柜中取出，右手緊握鏡臂，左手托住鏡座，將顯微鏡放在自己左肩前方的實驗臺上，鏡座后端距桌邊3.3～6.6cm為宜，便于坐著操作。
2）對光：用拇指和中指移動旋轉器（切忌手持物鏡移動），使低倍鏡對準鏡臺的通光孔（當轉動至聽到碰叩聲時，說明物鏡光軸已對準鏡筒中心）。打開光圈，上升聚光鏡，調節光圈大小，調節自帶光源的亮度旋鈕以改變亮度，直到視野內的光線均勻明亮為止。
3）放置玻片標本：取一玻片標本放在鏡臺上，一定使有蓋玻片的一面朝上，切不可放反，用推片器彈簧夾夾住，然后旋轉推片器螺旋，將所要觀察的部位調到通光孔的正中。
4）調節焦距：以左手按逆時針方向轉動粗調節器，使鏡臺緩慢地上升至物鏡距標本片約5mm處。應注意在上升鏡臺時，切勿在目鏡上觀察，一定要從右側看著鏡臺上升，以免上升過多，造成鏡頭或標本片的損壞。然后，兩眼同時睜開，在目鏡上觀察，左手順時針方向緩慢轉動粗調節器，使鏡臺緩慢下降，直到視野中出現清晰的物像為止。
如果物像不在視野中心，可調節推片器將其調到中心（注意玻片移動的方向與視野物像移動的方向是相反的）。如果視野內的亮度不合適，可通過升降聚光鏡的位置或調整光圈的大小來調節。如果在調節焦距時，鏡臺下降已超過工作距離（>5.40mm）而未見到物像，說明此次操作失敗，則應重新操作，切不可盲目地上升鏡臺。
（3）高倍鏡的使用方法
1）選好目標：一定要先在低倍鏡下把需進一步觀察的部位調到中心，同時把物像調節到最清晰的程度，再進行高倍鏡的觀察。
2）轉動轉換器，調換高倍鏡頭：轉換高倍鏡時轉動速度要慢，并從側面進行觀察（防止高倍鏡頭碰撞玻片），如高倍鏡頭碰到玻片，說明低倍鏡的焦距沒有調好，應重新操作。
3）調節焦距：轉換好高倍鏡后，用雙眼在目鏡上觀察，此時一般能見到一個不太清楚的物像，可將細調節器的螺旋逆時針轉動0.5～1 圈，即可獲得清晰的物像（此時切勿再用粗調節器!）。如果視野的亮度不合適，可用聚光鏡和光圈加以調節。當需要更換玻片標本時，必須順時針（切勿轉錯方向）轉動粗調節器使鏡臺下降，方可取下玻片標本。
（4）油鏡的使用方法
1）在使用油鏡之前，必須先經低、高倍鏡觀察，然后將需進一步放大的部分移到視野的中心。
2）將聚光鏡上升到最高位置，光圈開到最大。
3）轉動轉換器，使高倍鏡頭離開通光孔，在需觀察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢轉動油鏡。在轉換油鏡時，從側面水平注視鏡頭與玻片的距離，使鏡頭浸入油中而又不以壓破玻片為宜。
4）微調焦：一般情況下，從高倍鏡轉到油鏡即可觀察到物像，用雙眼于目鏡觀察，并慢慢轉動細調節器至物像清晰為止。轉動過程中，油鏡可能會離開油滴，此時，需要再小心地將鏡頭浸入油滴中，最好使鏡頭盡量貼近玻片，然后再微調使之逐漸遠離玻片，防止玻片與鏡頭的碰撞。
如果不出現物像或者目標不理想要重找，在油區之外重找時的程序為：低倍→高倍→油鏡；在油區內重找的程序為：低倍→油鏡，此時不可使用高倍鏡，以免油沾污鏡頭。
5）調節孔徑光圈和視場光圈，將孔徑光圈調到最大，與油鏡的數值孔徑相匹配，再調節視場光圈和自帶光源的旋鈕以達到最佳亮度。
6）油鏡使用完畢，將載物臺遠離鏡筒，先用擦鏡紙蘸少許二甲苯將鏡頭上和標本上的香柏油擦去，然后再用干擦鏡紙擦干凈。
【注意事項】
1. 持鏡時必須是右手握臂、左手托座的姿勢，不可單手提取，以免零件脫落或碰撞到其他地方。
2. 輕拿輕放，不可把顯微鏡放置在實驗臺的邊緣，以免碰翻落地。
3. 保持顯微鏡的清潔，光學和照明部分只能用擦鏡紙擦拭，機械部分用布擦拭。
4. 水滴、乙醇或其他藥品切勿接觸鏡頭和鏡臺，如果沾污應立即擦凈。
5. 放置玻片標本時要對準通光孔中央，且不能反放玻片，防止壓壞玻片或碰壞物鏡。
6. 不要隨意取下目鏡，以防塵土落入物鏡；也不要任意拆卸各種零件，以防損壞。
7. 使用完畢后，取下標本片，轉動轉換器使鏡頭離開通光孔，下降鏡臺，下降聚光鏡，關閉光圈，推片器回位，蓋上外罩，放回鏡箱內。最后填寫使用登記表。
【思考題】
1. 調節聚光鏡及使用油鏡時應注意哪些事項？
2. 為什么使用高倍鏡和油鏡時，必須從低倍鏡開始？
實驗2 光學顯微鏡標本的制作技術及HE染色
【實驗目的】
1. 掌握光學顯微鏡標本的制作方法。
2. 掌握HE 染色標本的染色特點，了解HE 染色的過程。
【實驗原理】光學顯微鏡的標本制作方法很多，常用的有：分離法、涂片法（血細胞、分離細胞或脫落細胞）、壓片法、鋪片法（疏松結締組織可撕成薄片）、磨片法（牙和骨等堅硬組織可磨成薄片）、血管注射法、切片法，多數都需經過染色后才能在鏡下觀察。
石蠟切片是最基本的切片技術，冰凍切片和超薄切片等都是在石蠟切片的基礎上發展起來的。蘇木精（hematoxylin）與伊紅（eosin）對比染色法（HE 染色）是組織切片最常用的染色方法。這種方法適用范圍廣泛，對組織細胞的各種成分都可著色，便于全面觀察組織構造，而且適用于各種固定液固定的材料，染色后不易褪色，可長期保存。經過HE 染色，細胞核被蘇木精染成藍紫色，細胞質被伊紅染色呈紅色。
【實驗用品】
1. 實驗器具切片刀、切片機、恒溫箱、顯微鏡、溫度計、水浴鍋、溫臺、熔蠟爐、蠟杯、酒精燈、蠟鏟、展片臺、解剖刀、解剖針、解剖剪、解剖盤、培養皿、吸管、鑷子、單面刀片、臺木、毛筆、包埋紙盒、染色缸、蓋玻片、載玻片、玻片盤、樹膠、樹膠瓶。
2. 實驗試劑
（1）Carnoy 固定液：甲醇∶冰醋酸=3∶1。
（2）Ehrich 蘇木精染液：取蘇木精1.0g，冰醋酸5ml，乙醇50ml，甘油50ml，硫酸鋁鉀5g，蒸餾水50ml。將蘇木精溶于少量的乙醇中，再加冰醋酸并攪拌，以加速其溶解。當蘇木精溶解后將甘油加入并搖動容器，同時加入剩余的乙醇。硫酸鋁鉀需研磨并加熱，然后溶解于蒸餾水中，將其逐滴加入染色劑中，并不斷搖動，瓶口用紗布蓋好，置于通風處，經常搖動以促其成熟，待顏色變為紫紅色時即可使用，成熟時間需2～4 周或數月之久。
（3）伊紅Y 染液：伊紅Y 1.0g，蒸餾水75ml，95%乙醇25ml，冰醋酸1 滴或2 滴。先將少量蒸餾水加入伊紅Y 中，用研缽將伊紅Y 研碎溶解，再加入全部的蒸餾水，混勻溶解后，加入乙醇、冰醋酸。
（4）甘油蛋白貼片劑：將1個雞蛋打破入碗或杯中，去蛋黃留下蛋白，用玻棒調打成雪花狀泡沫，然后用粗紙或雙層紗布過濾到量筒中，經數小時或一夜，即可濾出透明蛋白液。然后加入等量甘油，稍稍振搖使兩者混合。最后加入水楊酸鈉1g 作防腐用。可保存幾個月。
（5）1%鹽酸乙醇液：濃鹽酸1 份，70%乙醇99 份。
（6）其他：各級乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯，中性樹膠。
3. 實驗材料鼠肝、腎等動物組織。
【方法與步驟】
1. 石蠟標本的制作
（1）取材：斷頸處死小鼠，迅速取材，組織塊厚度不超過0.5cm。
（2）固定：將組織塊浸入Carnoy固定液中進行固定，以保持其本來的結構。
（3）制成蠟塊。
1）脫水：為了避免組織過度收縮，脫水過程應從低濃度乙醇開始，在70%、80%、90%、95%的乙醇中各浸6～12h，100%乙醇中3～4h。
2）透明：在二甲苯內至組織塊透明為止。
3）浸蠟：透明后的組織塊放入熔化的石蠟中（56～60℃），浸2～3h，使石蠟充分浸入組織內部。
4）包埋：先在模具中加入一些液態石蠟，待稍微冷卻，然后再將待包埋的組織置于石蠟之中，并排列整齊，再將塑料模具盒蓋上，最后加入少許液體石蠟，使石蠟變成固態。