製藥工業水污染物環境風險生物預警技術（簡體書）

近年來，醫藥產業的快速發展給全球，特別是發展中國家帶來了前所未有的新的環境壓力，《製藥工業水污染物環境風險生物預警技術》從製藥廢水環境危害預警人手，以污染物排放的環境效應和生態後果為評估準則，綜合了環境科學、生態學、生物數學等學科的研究成果和技術方法，以微生物一原生動物一底棲動物一水生植物的多系統校驗為保證，實施環境風險分析，並創新性地增設了系統自評估模塊，建立了一套簡便、可靠、實用的製藥廢水環境風險預警技術。
《製藥工業水污染物環境風險生物預警技術》可供各級環保主管部門、環境監測單位工作人員，各類涉及製藥企業環評的機構和個人，製藥企業相關工作人員，科研院所從事生態、環保、風險評估等研究的科研人員和師生使用。

《制藥工業水污染物環境風險生物預警技術/環保公益性行業科研專項經費項目系列叢書》編著者王曉龍等。
世界上，除我國等少數國家外都將制藥企業廢水分為提取類、化學合成類、發酵類、混裝制劑類和生物工程類5大類；我國還設有中藥類。制藥廢水的污染物構成、潛在的毒性是已知各種廢水中對環境、生態影響最深、危害最大的廢水種類之一。制藥廢水排放地的水環境微生物與其他生物具有參與環境物質循環和環境修復等功能，一方面，這些水生環境微生物與其他生物的改變直接影響環境健康，進而影響到水生環境的"微生物-藻類-原生動物-大型底棲動物-植物"整個生態系統，進而影響到當地環境的生態平衡，造成嚴重的和相當的時間內難以恢復的生態效應；另一方面，利用能反映廢水對排放地水體環境影響水平的重要指示菌及其共有生態系的動物、植物類群，建立廢水與排放地水體環境變化的動態關系，可以實現"種群消長規律-監測手段-環境改變"的監測目的，并探索建立廢水對環境微生物及其共有生態系影響的環境風險分析平臺。

前言
第1章 製藥工業水污染物環境風險預警技術概述
1.1 預警技術簡介
1.1.1 預警技術的含義
1.1.2 預警技術在各行業的運用
1.2 製藥工業水污染物環境風險預警技術的發展
1.2.1 製藥行業的發展狀況
1.2.2製藥工業水污染物排放現狀
1.2.3 製藥工業水污染物防治研究進展
1.2.4 製藥工業水污染物環境風險分析的研究進展
1.3 製藥工業水污染物環境風險預警與公共安全的關係
1.3.1 製藥工業水污染物具有公共安全危害性
1.3.2 實施製藥工業水污染物環境風險預警可以保障公共安全

第2章 指示生物在製藥工業水污染物環境風險評價中的應用
2.1 指示生物的篩選原則
2.1.1 指示生物篩選的一般原則
2.1.2 指示生物法常用的指示方式和指標
2.1.3 製藥工業水污染物環境風險指示生物的篩選原則
2.2 環境微生物類指示生物的選擇方法
2.2.1 樣品採集和保存原則
2.2.2 微生物接種和純培養
2.2.3 微生物區系分析原則
2.2.4 指示微生物篩選
2.3 水生動物類指示生物的選擇方法
2.3.1 水生動物區系及其生態特點
2.3.2 水污染對水生動物的影響及其反饋作用
2.3.3 指示動物的選擇與鑒定
2.4 水生植物類指示生物的選擇方法
2.4.1 水生植物類指示生物的篩選原則
2.4.2 指示生物的選擇與鑒定
2.5 指示生物鑒定
2.5.1 相關性檢驗——皮爾森相關性檢驗
2.5.2 指示生物自身適應性（生物特性）評價
2.5.3 依據擬合函數的指示生物選擇可靠性評價
2.5.4 風險區域劃分合理性評價——商值法

第3章 基於指示生物活性與製藥工業水污染物劑效關係的風險分析
3.1 指示生物活性與製藥工業水污染物劑效關係分析
3.1.1 水生微生物
3.1.2 水生動物
3.1.3 水生植物
3.2 基於多系統結論的風險劃分
3.2.1 多系統劑效關係的統
3.2.2 基於多系統結論的風險劃分

第4章 宏基因組學與製藥廢水污染監測
4.1 宏基因組學研究方法概述
4.1.1 基本原理
4.1.2 總DNA獲取
4.1.3 載體及受體菌研究進展
4.1.4功能基因篩選研究進展
4.1.5 宏基因組測序及數據分析
4.2 宏基因組學在環境保護和污染修復中的應用
4.2.1 分析微生物種群多樣性，監測和評價環境健康
4.2.2 挖掘降解基因和功能菌株，進行生物修復
4.3 第二代i貝4序技術及其應用
4.3.1 第二代測序技術特點
4.3.2 第二代測序技術的原理與分類
4.3.3 第二代測序技術在水質監測上存在的問題與思考
4.3.4 第二代測序技術在水質監測上的應用前景與發展趨勢
4.3.5 基於第二代測序技術的水體微生物樣品16s rDNA的宏基因組實例分析

第5章 製藥工業水污染物排放環境風險定量分析
5.1 風險分析中污染源整體與個體的劃分
5.1.1 污染源整體與個體的劃分問題
5.1.2 污染源整體風險的數字化
5.1.3 個體污染物風險的數字化
5.2 製藥工業水污染物整體風險定量分析
5.2.1 製藥廢水與各污染因子的定量分析
5.2.2 基於指示微生物的定量分析
5.2.3 基於指示動物的定量分析
5.2.4 基於指示藻類的定量分析
5.2.5 整體風險的最後確定
5.3 單一因子或組合因子風險定量分析
5.3.1 單一因子風險定量分析
5.3.2 組合因子風險定量分析

第6章 環境風險外推
6.1 風險外推的理論支撐
6.1.1 風險外推的定義及需求
6.1.2 風險外推的方法
6.1.3 目前風險外推方法的不足
6.2 環境風險外推
6.2.1 基於生物學原理的製藥工業水污染物風險外推
6.2.2 基於數學模型的製藥工業水污染物風險外推
6.2.3 生物學數學外推的聯合應用

第7章 製藥工業水污染物環境風險預警
7.1 預警時機的確定
7.1.1 各行業的預警時機
7.1.2製藥工業水污染物風險預警的時機
7.2 製藥工業水污染物風險趨勢分析
7.2.1 “灰色模型”理論
7.2.2 製藥工業水污染物風險趨勢的“灰色模型”分析
7.3 製藥工業水污染物風險趨勢分析與環境及社會政策的關係
7.3.1 製藥廢水中各污染因子的貢獻
7.3.2 製藥工業水污染物風險趨勢與環境的關係
7.3.3 製藥工業水污染物風險走勢與社會政策關係
7.4 製藥工業水污染物風險可視化技術
7.4.1 製藥工業水污染物風險可視化的原理
7.4.2 製藥工業水污染物風險可視化的呈現
參考文獻
彩圖

第1章制藥工業水污染物環境風險預警技術概述
1.1預警技術簡介
1.1.1預警技術的含義
預警（forewarning）是指在災害或災難以及其他需要提防的危險發生之前，根據以往總結的規律或觀測得到的可能性前兆，向相關部門發出緊急信號，報告危險情況，以避免危害在不知情或準備不足的情況下發生，從而最大限度地減少危害所造成的損失的行為。
預警研究可以分為自然災害預警、經濟預警、社會和政治預警三類（趙旭、辛志高，2010）。預警技術（warningtechnique）是指在危險發生之前用來預告以及警示人們所采用的一種方法和手段。
任何風險的發生必然有一定的原因與條件，風險的爆發會經歷一個演變、呈現的階段，因此各行業可對其體系的變化進行分析和研究，并利用一定的風險評估模型對風險進行評估和預測，再利用一定的技術手段進行監測和呈現（袁志祥等，2007）。
隨著科學技術的高速發展以及監測系統和風險評估模型的完善，各行各業的預警技術也日趨完善，使得許多風險在爆發、失控前得到制止或脫離。
本書開發的制藥工業水污染物風險預警技術，針對國控藥廠在線監測的污染因子波動，將被監測的污染因子進行綜合定量分析，以生物學原理和數學原理指導環境風險外推，并運用灰色模型預測未來水污染物的環境風險，最終借助計算機操作平臺，以可視化的形式呈現制藥工業水污染風險趨勢。
該預警技術不僅能與國家在線監控的藥廠相銜接，為國家環保部門對制藥工業水污染物的管理提供便利，而且也可以用于監測非國控小型制藥企業水污染物排放的風險，為藥廠周圍人民的生活安全提供保障。
1.1.2預警技術在各行業的運用
隨著科學技術的進步及社會發展的需求，預警技術廣泛應用于政治、經濟、科技、軍事、社會、文化、教育、醫療等各個領域。預警技術在世界范圍內對各領域的風險控制和有效管理在不同程度上起到了有力的推動作用，是目前風險爆發前實施有效制止或脫離其目標的最佳選擇。
1.預警技術在自然領域的應用
突發的氣象災害給人們的工作、出行、生活經常帶來很多的不便，20世紀二三十年代世界主要海洋國家就開始了風暴潮的監測、預警、預報研究工作。20世紀70年代我國也開始進行風暴潮的監測、預警、預報工作（陳敏、丁明云，2009）；2006年5月18日中國氣象局開通了中國氣象頻道，不僅向全國提供權威的氣象信息，而且及時地對自然災害進行預警預報（中國氣象局，2008；吳孟春等，2010）。
地震是一種嚴重的自然災害，它的突發會給人們的生命財產及安全造成難以彌補的損失，為了讓人們更早地預知地震的發生，在1868年美國的Cooper就建立了早期地震預警系統，國外許多國家（如日本、澳大利亞、德國、土耳其、立陶宛等）的地震預警技術發展很快，中國的地震專家對地震預警技術和預警系統的應用也進行了深入的思考和構想，為中國的防震減災作出了許多貢獻。
2.預警技術在經濟領域的應用
殷克東等對中國海洋經濟波動監測技術進行的研究，反映出了海洋經濟發展的重要指標，通過預警研究使海洋災害的損失占海洋GDP的比重降到了9年以來的最低（殷克東、馬景灝，2010）。
20世紀70年代，國外出現了企業戰略風險管理、基于風險價值的資產評估等研究（Ries，2001；MulveyandErkan，2009），佘廉（1999）是我國最早提出建立企業預警管理系統的學者。
3.預警技術在醫療領域的應用
SARS之后，我國各級政府加快了公共衛生體系的預警機制建立，在公共衛生突發事件早期預警方面有了一定成效（舒彬等，2005）。
陳莉萍等（2011）對2009年醫院內科系統發生的醫療糾紛、醫療差錯、醫療投訴等醫療不良事件進行統計分析，實施了風險預警管理后，內科醫療不良事件發生次數明顯減少。
1.2制藥工業水污染物環境風險預警技術的發展
1.2.1制藥行業的發展狀況
由于世界人口數量不斷增長及社會老齡化進程加快等原因，全球醫藥市場增長率遠遠高于全球經濟增長率。在全球范圍內，2006年藥品市場銷售總額高達6430億美元，2007年藥品銷售總額超過7000億美元，到2009年，藥品銷售總額同比增長2.5%~3.5%。IMSHealth發布的2009年全球藥品市場增長預測（TheGlobalPharmaceuticalMarketGrowthForecastin2009）指出，相對于金融行業，制藥業受金融危機影響較小。
2006年，美國以年銷售額2890億美元位居全球第一制藥大國，其銷售額在全球占有率約為45%，日本、歐盟等國家緊隨其后。在過去的幾年里，美國等發達國家為了降低成本及環保壓力，近60%的低端化學原料均從歐洲的愛爾蘭、西班牙、比利時等國家購買，大大減少了制藥行業給本國帶來的環境污染。截止到2007年，我國原料藥出口量已居世界的榜首，其總金額高達78億元，無形之中對我國的環境帶來很大的威脅（制藥工業污染防治技術政策編制組，2009）。
自新中國成立以來，我國制藥行業迅猛發展，由最初的幾家小制藥廠發展到如今的近6000家藥廠。雖然我國的制藥企業數量較多，但大多規模較小，其中中小型的藥企占有率高達83.4%，因此我國新藥研發的能力低，產品技術含量低，污染治理水平低，進而經濟效益偏低。我國制藥行業呈現“一小、二多、三低”的特點。“十一五”期間，國家發改委提出我國要努力發展現代醫藥生物技術，同時對醫藥行業進行資源整合，以培養出具有國際實力的大型醫藥集團，特別提出在發展的同時要保護資源及生態環境，堅持走醫藥行業的可持續發展道路。到2010年年底，我國醫藥工業總產值已達到140億元。“十二五”期間提出的重點是加大化學藥新品種、生物技術制藥、現代中藥、先進醫療器械、新型藥用輔料包裝材料與制藥設備的發展力度，并快速推進各領域新技術的研發及應用。
不僅如此，工業轉型升級規劃對醫藥行業還提出了更高的要求：“十二五”期間，醫藥工業總產值的年均增長率在20%以上，高于其他所有工業年均增長率的8%。與此同時，醫藥工業“十二五”發展規劃也指出，我國不僅要開發出30個以上通用名藥物的新品種，而且要完成200個以上大品種醫藥的改造升級。
1.2.2制藥工業水污染物排放現狀
制藥工業是我國環保規劃治理的重點行業之一，其廢水排放量占整個工業廢水排放量的2%，具有“濃度高、毒性大、色度深”等特點，是水污染源的重點之一（環境保護部，2008f；Kabdaslietal.，1999）。
由于經濟技術不發達，發展中國家很多制藥廠是初級制藥，供發達國家的藥企進行深加工以提高藥效和效益，這種模式對于發達國家而言產污量比較低，產生價值更高，對生產初級產品的國家卻會帶來不可估量的環境危害。
由于我國制藥行業的迅猛發展，以及廢水處理技術的相對落后，制藥工業水污染物亂排現象嚴重：在2011年6月5日，也就是世界環境日當天，哈藥總廠由于違規排放廢水、廢氣、廢渣，氨氮排放超標20倍，硫化氫超標1150倍，嚴重污染了周邊環境，被媒體曝光；2009年，石家莊某藥廠排污管道違規排污被責令拆除；2007年，聯邦制藥彭州污染事件，政府7次下令要求整改；2003年8月，海正藥業（臺州市椒江工業園區）違規排污，造成3死8傷。制藥工業廢水亂排亂放對生態環境造成了嚴重危害，直接威脅了人類的生活環境及人們的人身安全，值得政府及每一個人關注。
1.2.3制藥工業水污染物防治研究進展
1.國外制藥工業水污染物的防治概況
在世界范圍內，美國最早開展了水環境基準的研究工作，對世界各國產生了較為深遠的影響。
20世紀60年代，美國就相繼發表了綠皮書（1968年）、藍皮書（1972年）、紅皮書（1976年）以及金皮書（1986年）（USDepartmentoftheInterior，1968；NASandNAE，1972；USEPA，1976，1986），為美國各州水質標準的制定提供了依據。
美國及歐盟的一些發達國家針對制藥工業水污染物的處理有著相對健全的政策及法規，也具有比較先進的處理技術。1976年，美國環保部首次發布了制藥工業4種點源污染物（化學需氧量、生化需氧量、總懸浮物、pH）的排放標準。1982年將其修訂，增加了制藥工業點源氰化物的排放限值，并且所有污染物的排放均必須基于BAT（經濟上可行的最佳可得技術）、BCT（最佳常規污染物控制技術）的排水限值以及NSPS（新建企業執行標準）、PSES（現有污染源預處理標準）和PSNS（新建企業預處理標準）。1985年、1986年又分別再次發布修訂稿，1998年9月發布了最新的標準版本（63FR50424，40CFR439），直到現在，美國制藥工業一直執行該標準，該標準也為世界各國標準的制定提供了參照。
與此同時，1998年世界銀行也頒布了污染預防與消減手冊（PollutionPreventionandAbatementHandbook），其中明確指出了制藥工業三廢（廢氣、廢水、廢渣）的排放標準。
歐盟在某些工藝和工業裝置的有機溶劑排放限制（TheLimitationofOrganicSolventsFromCertainProcessesandIndustrialInstallations）中，對制藥工業有機溶劑的排放做出了規定，要求企業每年提交一次責任書或相關數據，以證明其達標情況（制藥工業水污染物排放標準――發酵類編制組，2007）。
盡管目前全世界已制定的水質標準中涉及的化學物質不足全球已知污染物的0.1%，但是水質排放標準仍然是工業廢水排放監測和風險管理的根本依據。美國是最早制定水質排放標準的國家，它是根據已有的毒性數據，采用數學模型推導出污染物的基準濃度。早在1988年，美國不僅規定了廢水特征污染物濃度和負荷的排放標準（Thomas，1988），而且還制定了廢水毒性排放標準，為全球廢水排放基準的制定提供了參考，同時也為工業廢水的監測及預警提供了依據。
20世紀50年代，美國的研究人員首次進行了工業廢水對魚的毒性試驗，隨后英國于1996年引入生態毒性檢測法監控組分復雜的污水排放，法國、德國、意大利和瑞典也采用了生態毒性檢測控制工業廢水的排放，德國已經將生態毒性檢測引入水環境管理法規（UKEnvironmentAgency，1996a，1996b；陳建等，2007）。
生態毒性檢測在發達國家已成為工業廢水排放監控和風險管理的有效手段（Thomas，1988；WharefeandTinsley，1995）。但隨著廢水污染物對人類健康的危害加劇，生態毒性檢測的是總的生物學反應，并不能得知污水的毒性是由哪些成分引起的，因此不能有效地控制污水，進而不能及時預警。
到了20世紀90年代，美國率先開發的毒性鑒別評價法（ToxicityIdentificationEvaluation，TIE）的應用，不僅可以指出引起廢水污染的關鍵有毒化合物，而且可以計算出其對廢水生態毒性的貢獻率，能直接評估廢水對生態的影響（Thomas，1988），有助于對廢水的監控和預測。
目前，國外科研人員對廢水造成的生態風險的分析逐漸趨于定量化，表征生態風險的方法也有很多種，如商值法（Hernandoetal.，2006）、概率密度函數重疊面積法（SolomonandSibley，2002）、聯合概率曲線法、模糊數學綜合法等。國外廢水環境管理的風險評價法已趨成熟，許多發達國家人力、物力、財力充足，毒性監測設備完善，計算機模擬發展迅速，使得制藥工業廢水中某些污染物的預警相對可靠。
2.國內制藥工業水污染物的防治概況
我國對于廢水排放的研究起步較晚，其排放標準的基礎研究十分薄弱，很多水質標準都是參考或引用國外相關標準而制定的。
1973年，我國首次頒布了污染物排放標準，即工業“三廢”排放試行標準（GBJ4―1973）。1988年4月5日，國家環境保護總局批準廢水綜合排放標準GB8978―1988），該標準不僅將制藥工業劃分為化學制藥工業與生物制藥工業，同時也包含了石油開發工業、合成脂肪酸工業、硫酸工業、輕金屬工業等水污染排放標準。1996年頒布了污水綜合排放標準GB8978―1996），從1998年1月1日開始實施，取代了GB8978―1988，新的標準中將原料藥的COD、氨氮等標準值分為三個等級進行管理，并且針對1998年后建設的制藥企業，還規定了56種污染物排放限值。
直到2008年，制藥工業水污染物排放標準（GB―2008）出臺，明確給出了六類（混裝制劑、生物工程、發酵、提取、合成、中藥）藥廠不同污染物的排放標準。歷經30多年，我國制藥行業的廢水排放標準才相對完整。
近幾年，由于制藥行業污染事件頻繁發生，國家為了解決此問題，環保部等相關部門在處理廢水上做了很多工作。各大高校及制藥工業水污染物專業研究人員也開展了許多工作，氣浮法、吸附法、混凝法、深度氧化法、生物膜法、加壓生化法等數十種物化、生化及化學方法（潘志彥等，2004；林禾，2007）得以開發利用。
然而由于制藥工業水污染物濃度高、成分復雜、難降解等特點，廢水處理難度很大，加之不同藥廠廢水的處理工藝不同，各藥廠廢水處理費用很高。因此僅僅依靠處理設備及工藝防治制藥工業水污染物的污染已經不是萬全之策，制藥工業水污染物的環境風險預警、預報需求迫在眉睫。
關于制藥工業水污染物預警技術的研究在國內很長一段時間鮮有報道，主要是因為在當時并沒有將制藥工業水污染物從工業廢水中分離。目前，化學監測法是我國工業廢水進行污水監控的主要方法，已有20多年的歷史，它僅以COD等極少參數反映廢水的毒性，但并不能有效控制復合有機毒物。隨著科學技術的發展，以及工業污水的現實狀況，污水在線監測系統已在我國逐步應用（趙銀慧、朱建平，2002；曹等，2002）。例如，范彩安、彭永臻等人利用DO在線監測并判斷制藥工業水污染物毒性，意在通過DO值反映制藥工業水污染物的風險（范彩安等，2003）。
近幾年，生物在線監測系統的研發充分利用在線監測的優點，彌補了化學監測法的不足，中科院生態中心研究員王子健等研究出一套在線生物安全預警系統，它可以用于多類水源中的化學品的綜合污染監控和預警。由于制藥工業水污染物的復雜性和高濃度影響了生物在線監測預警系統的準確性，因此還在進一步的研究中（鄭新梅等，2011）。
隨著科學技術的發展，在線監測系統逐步完善，但是關于制藥工業水污染物整體風險的研究并不突出。
隨著國外方法的引進，定性分析及定量分析在我國廢水風險評價中逐漸應用，智昕等運用商值法、概率風險評價法等對長江水系武漢段有機農藥污染進行了生態風險評價（智昕等，2008）；潘孝輝等運用模糊數學綜合評價法對黃浦江水環境進行了綜合評價（潘孝輝等，2008），這些報道雖然表明我國對廢水的環境風險評估已經走向定量化，但
是目前的研究還多是對廢水中某些污染物的風險評估，鑒于我國制藥工業發展迅速，其產生的廢水嚴重污染人們的生活環境，我國現實情況更要求對制藥工業水污染物在線監測的污染因子進行整體定量分析，并進行預警。
1.2.4制藥工業水污染物環境風險分析的研究進展
1.風險分析的主要方法
風險普遍存在于人類的生活中，它一般是指在某一特定情況下危險發生的可能性與后果的組合，即遭受損壞、損失或傷害的可能性，也就是人們不希望出現的結果的可能性（郭仲偉，1987），如污染風險、健康風險、災害風險等。
從嚴格意義來說，風險分析就是指在一定時期發生有害事件的概率與有害事件后果的乘積（胡二邦，2000），即R［危害／單位時間］＝P［事故／單位時間］×C［危害／事故］。風險分析是指對可能遇到的自然環境的災難和危害的潛在頻率和后果，所提出的各種備選方案，作出評估和分析。
不同類型的風險分析所運用的方法不同，但是隨著經濟發展及計算機水平的日新月異，風險定量分析逐漸取代定性分析，應用于各個類別的風險分析。例如，在防洪工程風險分析中，Tung建立的漫頂風險模型（TungandMays，1981a，1981b；Tung，1987）、Duckstein總結了防洪堤失事概率的求算（DucksteinandBogardi，1981），同樣國內的王卓甫等（1998）、李國芳等（1999）、汪新宇等（2004）也都對防洪堤壩的風險進行了定量分析。
在水污染的風險分析中，廢水造成的生態風險也正在趨于定量化的研究（孫華蓉、王曉龍，2011），表征生態環境風險的方法也有多種。從最初美國研究的毒性鑒別評價法（ToxicityIdentificationEvaluation，TIE）（Amatoetal.，1992；USEPA，1993；Doi，1994），到現在的AHP模糊數學綜合法、商值法、概率密度函數重疊面積法（SolomonandSibley，2002）、聯合曲線法等都有了長足的進步，而且發展空間依然巨大。
2.國內外研究進展和發展狀況
關于廢水的風險分析，目前許多發達國家已經從定性分析發展到定量分析。美國是首先研究水質排放標準的國家，根據檢測到的毒性數據，利用合理的數學模型，推出水中污染物的排放標準濃度（陳建等，2007）。到1996年，英國已經制定出了全部廢水污染物毒性排放的標準（UKEnvironmentAgency，1996a，1996b），但是該標準對于制藥工業水污染物排放的控制只是起到一個參照作用，并不能完全依靠此標準處理制藥工業水污染物。
進入20世紀50年代，人們開始運用生態毒理學監測環境風險。美國的科研人員首次用魚研究工業廢水的危害，結果顯示了污染物濃度與生物學反應的定量關系（Thomas，1988；Amatoetal.，1992）。之后英國、德國、法國、意大利、瑞典等發達國家都采用生態毒理學方法測定工業廢水的毒性。然而生態毒理學的方法僅僅是確定廢水對生物是否產生毒害，人們為了確定污染物的來源，20世紀90年代，美國首先研究。