臨床微生物學檢驗實驗指導（簡體書）

《臨床微生物學檢驗實驗指導》是全國高等院校醫學檢驗專業實驗教學規劃教材之一。全書分三篇，共二十五章。第一篇臨床微生物檢驗基本技術，前四章主要介紹細菌形態學檢查、細菌分離培養技術、細菌鑒定技術、抗菌藥物敏感性試驗及耐藥監測，第五至十五章為臨床常見病原微生物的培養、鑒定或檢測方法，通過實驗課的教學，加強學生對基礎理論、基本知識和基本技能的掌握。第二篇綜合性實驗從標本送檢要求、檢驗程序、結果解讀等方面介紹臨床各類標本的細菌學檢測，有助於學生綜合掌握和運用所學知識，為臨床實習和工作打下基礎。第三篇研究創新性實驗重點在培養學生進行科學研究的興趣和基本方法。《臨床微生物學檢驗實驗指導》可作為高等院校醫學檢驗專業、衛生檢驗專業學生實驗用書，也可供臨床檢驗工作者和從事醫學研究的科研人員參考使用，並可用做臨床醫學、醫學影像學、麻醉學、法醫學、預防醫學及藥學等專業實驗教學的參考用書。·

《全國高等院校醫學檢驗專業實驗教學規劃教材:臨床微生物學檢驗實驗指導》可作為高等院校醫學檢驗專業、衛生檢驗專業學生實驗用書，也可供臨床檢驗工作者和從事醫學研究的科研人員參考使用，并可用做臨床醫學、醫學影像學、麻醉學、法醫學、預防醫學及藥學等專業實驗教學的參考用書。

第一篇 臨床微生物檢驗基本技術第一章 細菌形態學檢查第一節 顯微鏡的使用第二節 不染色標本檢查第三節 細菌的塗片和革蘭染色第四節 細菌的特殊染色技術和觀察第二章 細菌的分離培養技術第一節 培養基製備技術第二節 細菌的接種技術第三節 細菌的培養方法第四節 細菌生長現象觀察第三章 細菌鑒定技術第一節 生物化學鑒定第二節 血清學鑒定第三節 動物實驗與細菌毒素檢測第四章 抗菌藥物敏感性試驗與細菌耐藥性檢測第一節 紙片擴散法第二節 稀釋法第三節 E試驗第四節 聯合藥敏試驗第五節 臨床常用特殊耐藥菌及耐藥酶的表型檢測第五章 革蘭陽性球菌的培養和鑒定第一節 革蘭陽性球菌各屬間的鑒別第二節 葡萄球菌屬細菌鑒定第三節 鏈球菌屬和腸球菌屬細菌鑒定第六章 革蘭陰性桿菌的培養和鑒定第一節 革蘭陰性桿菌各科或屬之間的鑒別第二節 腸桿菌科細菌的鑒定第三節 非發酵革蘭陰性桿菌的鑒定第四節 苛氧菌的鑒定第七章 革蘭陰性球菌的培養和鑒定第八章 弧茵屬、彎麴菌屬和螺桿菌屬細菌的培養和鑒定第一節 弧菌屬第二節 空腸彎麴菌第三節 幽門螺桿菌第九章 需氧革蘭陽性桿菌細菌的培養和鑒定第一節 棒狀桿菌屬第二節 需氧芽孢桿菌屬第三節 產單核李斯特菌第十章 分枝桿菌屬、放線菌屬和諾卡菌屬細菌的培養和鑒定第一節 結核分枝桿菌第二節 放線菌屬第三節 諾卡菌屬第十一章 厭氧菌的培養和鑒定第十二章 螺旋體、支原體和衣原體的實驗室檢測第一節 梅毒螺旋體實驗室檢測第二節 沙眼衣原體實驗室檢測第三節 支原體實驗室檢測第十三章 醫院感染監測第一節 手衛生監測第二節 空氣衛生學監測第三節 物體表面致病菌監測第十四章 真菌的培養和鑒定第一節 真菌檢驗基本技術第二節 臨床常見淺部真菌培養和鑒定第三節 常見深部真菌培養和鑒定第十五章 病毒的培養和檢測第一節 病毒培養和檢測技術第二節 常見病毒的檢測第二篇 綜合性實驗第十六章 血液及骨髓標本的細菌學檢驗第一節 血液及骨髓標本的細菌學檢驗第二節 中心靜脈導管的細菌學檢查（Maki半定量法）第十七章 尿液標本的細菌學檢驗第十八章 呼吸系統標本的細菌學檢驗第一節 上呼吸道標本的採集、運送及處理第二節 下呼吸道標本的採集、運送及處理第三節 呼吸機相關感染第十九章 糞便標本的細菌學檢驗第二十章 腦脊液標本的細菌學檢驗第二十一章 生殖道標本的細菌學檢驗第二十二章 穿刺液及膿標本的細菌學檢驗第二十三章 臨床微生物學檢驗室內質量控制第三篇 研究創新型實驗第二十四章 創新型實驗實施原則和方法第二十五章 創新型實驗參考文獻附錄附錄1 臨床微生物常用培養基附錄2 臨床微生物常用生化試驗培養基、試劑和染色法彩圖·

第一篇 臨床微生物檢驗基本技術
第一章 細菌形態學檢查
第一節 顯微鏡的使用
【實驗目的】
1.掌握光學顯微鏡的結構和原理。
2.掌握光學顯微鏡使用方法。
【實驗原理】
1.顯微鏡的基本結構 普通光學顯微鏡的構造主要分為兩部分：機械部分和光學部分。
（1）機械系統
1）鏡座：是顯微鏡的底座，用以支持和穩定整個鏡體。
2）鏡柱：是鏡座上面直立的部分，用以連接鏡座和鏡臂。
3）鏡臂：一端連于鏡柱，一端連于鏡筒，是取放顯微鏡時手握部位。
4）鏡筒：連在鏡臂的前上方，鏡筒上端裝有目鏡，下端裝有物鏡轉換器。
5）物鏡轉換器：位于鏡筒下端的旋轉盤，可自由轉動，盤上有3～4個物鏡孔。
6）載物臺：在鏡筒下方，用以放置標本，中央有一通光孔；裝有玻片標本推進器，推進器左側有彈簧夾，用以夾持玻片標本，鏡臺下有推進器調節輪，可調節標本位置。
7）調焦裝置：是裝在鏡柱上的大小兩種螺旋，可調節物鏡和標本之間的焦距。大螺旋稱粗調節器，移動時可使載物臺作較大幅度的升降，通常在使用低倍鏡時，先用粗調節器迅速找到物像。小螺旋稱細調節器，移動時可使鏡臺緩慢地升降，可作精密調焦，一般在高倍鏡下使用，可得到清晰的物像。
（2）光學系統
1）目鏡：裝在鏡筒的上端，其上刻有5×、10×或15×符號以表示其放大倍數，一般裝的是10×的目鏡，為便于指示圖像，鏡中裝有一根黑絲作為指針。
2）物鏡：裝在鏡筒下端的旋轉器上，一般有3～4個物鏡，其中最短的刻有“10×”符號的為低倍鏡，較長的刻有“40×”符號的為高倍鏡，最長的刻有“100×”符號的為油鏡，此外，在高倍鏡和油鏡上還常加有一圈不同顏色的線，以示區別。在物鏡上，還有鏡口率（N.A.）（也稱為數值孔徑）的標志，它表示該鏡頭分辨力的大小，其數字越大，表示分辨率越高。
3）照明裝置：裝在鏡臺下方，包括光源和集光器。光源一般采用普通燈光，強度可以自由調節。集光器位于鏡臺下方的集光器架上，由聚光鏡和光圈組成，其作用是把光線集中到所要觀察的標本上。
2.顯微鏡的放大成像原理 顯微鏡的分辨率是由所用光波長短和物鏡數值孔徑決定，縮短使用的光波波長或增加數值孔徑可以提高分辨率。減小光波波長來提高光學顯微鏡分辨率是有限的，提高物鏡數值孔徑是提高分辨率的理想措施。增加數值孔徑，一般通過提高介質折射率，以空氣為介質的折射率為1，而香柏油的折射率為1.51，和載玻片1.52的折射率相近，這樣光線可以不發生折射而直接通過載玻片、香柏油進入物鏡，從而提高分辨率。顯微鏡總的放大倍數是目鏡和物鏡放大倍數的乘積，而物鏡的放大倍數越高，分辨率越高。
【實驗器材】
普通光學顯微鏡、細菌革蘭染色標本、香柏油、擦鏡油、擦鏡紙。
【實驗方法】
1.取鏡和放置 從顯微鏡柜中取出顯微鏡，右手緊握鏡臂，左手托住鏡座，放在座前桌面上稍偏左的位置，鏡座應距桌沿6～7cm左右，便于坐著操作。
2.對光 打開光源開關，轉動旋轉器，使低倍鏡對準鏡臺的通光孔，打開光圈，上升集光器，在目鏡上觀察，調節光源強度至視野內的光線均勻明亮。
3.放置玻片標本 取一玻片標本放在鏡臺上，一定使有標本一面朝上，切不可放反，用推片器彈簧夾夾住，然后旋轉推片器螺旋，使玻片中被觀察的部分位于通光孔的正中央。
4.低倍鏡和高倍鏡使用 先用低倍鏡觀察，先轉動粗調焦手輪，使載物臺上升至物鏡距標本片約5mm處。并轉動粗調節器，使載物臺慢慢下降，直到視野中出現清晰的物像為止。如果物像不在視野中心，可調節推片器將其調到中心。轉動轉換器，調換為高倍鏡頭，在目鏡上觀察，此時一般能見到一個不太清楚的物像，可轉動細調節器，直到獲得清晰的物像。如果視野內的亮度不合適，可通過升降集光器的位置或開閉光圈的大小來調節。
5.油鏡的使用方法 在使用油鏡之前，先經低、高倍鏡觀察，然后將需進一步放大的部分移到視野的中心。將集光器上升到最高位置，光圈開到最大。轉動轉換器，使高倍鏡頭離開通光孔，在需觀察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢轉動油鏡，使鏡頭浸入油中，慢慢轉動細調節器至物像清晰為止。油鏡使用完畢，先用擦鏡紙沾少許擦鏡油將鏡頭上的香柏油擦去，再用干擦鏡紙擦干凈。
【實驗結果】
在顯微鏡油鏡下觀察到細菌形態。
【注意事項】
1.持鏡時必須是右手握臂、左手托座的姿勢，不可單手提取，以免零件脫落或碰撞到其他地方。
2.輕拿輕放，不可把顯微鏡放置在實驗臺的邊緣，以免碰翻落地。
3.保持顯微鏡的清潔，鏡頭必須用專用擦鏡紙擦拭，切忌口吹手抹或用布擦，機械部分用布擦拭。
4.使用完畢后，取下標本片，轉動旋轉器使鏡頭離開通光孔，下降載物臺和集光器，關閉光圈，蓋上外罩，放回顯微鏡柜內。
第二節 不染色標本檢查
【實驗目的】
了解不染色標本的觀察方法。
【實驗原理】
有鞭毛的細菌在液體中可以運動，而無鞭毛的細菌只能發生分子顫動，以此可以觀察細菌的運動能力。
【實驗器材】
1.菌種 變形桿菌、金黃色葡萄球菌8～12小時肉湯培養物。
2.其他 載玻片、蓋玻片、凹玻片、鑷子、接種環、顯微鏡和凡士林等。
【實驗方法】
1.壓滴法 用接種環取變形桿菌和金黃色葡萄球菌菌液各2～3環，分別置于兩張載玻片中央，用鑷子夾住蓋玻片覆蓋于菌液上。覆蓋時，先將蓋玻片一端接觸菌液緩緩放下，使玻片之間不產生氣泡，菌液不外溢為適。標本立即置顯微鏡下觀察，先低倍鏡找到標本，然后在高倍鏡下觀察。
2.懸滴法 取變形桿菌或金黃色葡萄球菌肉湯培養物1環分別置蓋玻片中央，在另一凹玻片凹窩的周圍涂少許凡士林，將凹面向下，對準蓋玻片中央，覆于其上，粘住蓋玻片后迅速翻轉，用小鑷子輕壓，使蓋玻片與凹玻片粘緊，密封凹窩邊緣，液滴即懸垂于凹窩中央。
先在低倍鏡下找到懸滴邊緣，再換用高倍鏡觀察。
【實驗結果】
無論是懸滴法還是壓滴法，有鞭毛的變形桿菌可見發生位移的運動現象，而無鞭毛的金黃色葡萄球菌不發生位置變化。
【注意事項】
1.不能使用陳舊的細菌培養物。
2.壓滴法的標本不能產生氣泡，以免影響觀察。
第三節 細菌的涂片和革蘭染色
【實驗目的】
1.掌握細菌涂片的制作。
2.掌握革蘭染
色方法、原理、結果觀察和意義。
【實驗原理】
革蘭染色法的原理尚不完全清楚，主要有3種學說：
1.通透性學說 革蘭陽性菌細胞壁結構較致密，肽聚糖層厚，脂質含量少，乙醇不易透入，反而使細胞壁脫水后形成一道屏障，阻止染料外滲。革蘭陰性菌細胞壁結構疏松，肽聚糖層薄，含大量脂質，乙醇易滲入，使細胞壁通透性增加，細胞內的染料容易被乙醇溶解脫出。
2.等電點學說 革蘭陽性菌等電點（pI2～3）比革蘭陰性菌（pI4～5）低，一般染料酸堿度在pH7.0左右，電離后革蘭陽性菌所帶的負電荷比革蘭陰性菌多，故與帶正電荷的堿性染料結晶紫結合牢固，不易脫色。
3.化學學說 革蘭陽性菌菌體含大量核糖核酸鎂鹽，可與碘、結晶紫牢固結合，使已著色的細菌不被乙醇脫色；革蘭陰性菌菌體含核糖核酸鎂鹽很少，故易被脫色。
【實驗器材】
1.菌種 金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌18～24小時斜面培養物。
2.其他 革蘭染液、玻片、生理鹽水、酒精燈、接種環、顯微鏡等。
【實驗方法】
1.細菌涂片標本的制作
（1）涂片：取潔凈玻片一張，用記號筆劃分兩格并標記金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌，用接種環按無菌操作取1～2環生理鹽水在玻片上，刮取少許菌苔，在生理鹽水中研磨成乳濁狀，涂成直徑約1cm2的均勻薄膜，然后立即將接種環燒灼滅菌。同法取大腸埃希菌液于另一格中涂片。
（2）干燥：涂片一般在室溫下自然干燥，若須迅速干燥，可將涂片膜面朝上，在火焰上方的熱空氣中加溫干燥，但切勿緊靠火焰，以免將標本烤干。
（3）固定：涂片干燥后，在酒精燈火焰上迅速來回通過三次，注意溫度不能太高，以玻片反面觸及皮膚，熱而不燙為度。固定的目的一是殺死細菌，二是使菌體與玻片黏附牢固，染色時不被染液和水沖掉，三是可凝固細胞質，改變細菌胞壁對染料的通透性。
2.革蘭染色步驟
（1）初染：將已固定的涂片置染色架上，滴加結晶紫1～2滴，1分鐘后用細水流輕輕沖洗。
（2）酶染：滴加碘液1～2滴，1分鐘后用細水流輕輕沖洗。
（3）脫色：95%乙醇溶液脫色，加乙醇后輕輕晃動玻片，約30秒后用細水流輕輕沖洗。
（4）復染：滴加稀釋石炭酸復紅1～2滴，30秒后用細水流輕輕沖洗。待標本自干或用吸水紙印干后，置油鏡下觀察。
【實驗結果】
金黃色葡萄球菌是革蘭陽性球菌，被染成紫色；大腸埃希菌是革蘭陰性桿菌，被染成紅色。
【注意事項】
1.涂片厚薄要適宜，菌膜應該薄而均勻。
2.水洗時，水流不宜過大，避免水流直接對準菌膜沖洗。
3.菌種應選用對數生長期的菌種。
第四節 細菌的特殊染色技術和觀察
【實驗目的】
1.掌握鞭毛染色法的基本原理和操作方法。
2.掌握芽孢染色法的基本原理和操作方法。
3.掌握莢膜染色法的基本原理和操作方法。
【實驗原理】
1.鞭毛染色法 在染色前先用媒染劑處理，讓它沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗，然后再進行染色。常用的媒染劑由丹寧酸和氯化高鐵或鉀明礬等配制而成。
2.芽孢染色法 芽孢是利用細菌細胞不同部分與染料的親和力不同，用特殊染色法使之顯示出不同的顏色。芽孢染色法就是根據芽孢具有既難以染色而一旦染上色后又不易脫色的特點而設計的。除了用著色力強的染料外，還需加熱以促進芽孢著色。孔雀綠染色法，此染料不僅可以進入菌體，而且也可以進入芽孢，進入菌體的染料可經水洗脫色，而進入芽孢的染料則難以透出，若再用沙黃進行復染，此時菌體即被染成紅色，而芽孢難著色，仍呈綠色，進而更明顯地襯托出芽孢，便于觀察。
3.莢膜染色法 由于莢膜與染料間的親和力弱，不易著色，通常采用負染色法，即設法使菌體和背景著色而莢膜不著色，從而使莢膜在菌體周圍呈一透明圈。由于莢膜的含水量在90%以上，故染色時一般不加熱固定，以免莢膜皺縮變形。
【實驗器材】
1.菌種 變形桿菌、枯草芽孢桿菌、肺炎鏈球菌。
2.染色液 Leifson染色液、芽孢染色液（5%孔雀綠水溶液、0.5%蕃紅水溶液）、莢膜染色液。
3.其他 載玻片、擦鏡紙、吸水紙、記號筆、玻片擱架、鑷子、接種環，顯微鏡。
【實驗方法】
1.鞭毛染色法
（1）清洗玻片：選擇新的玻片，為了避免玻片相互重疊，應將玻片插在專用金屬架上，然后將玻片置洗衣粉過濾液中（洗衣粉煮沸后用濾紙過濾，以除去粗顆粒），煮沸20分鐘。取出稍冷后用自來水沖洗、晾干，再放入濃洗液中浸泡5～6天，使用前取出玻片，用自來水沖去殘酸，再用蒸餾水洗。將水瀝干后，放入95%乙醇溶液中脫水。
（2）菌液的制備及制片：在染色前將待染細菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培養基斜面上連續培養3～5代，以增強細菌的運動力。最后一代菌種培養12～16小時后，用接種環挑取斜面與冷凝水交接處的菌液數環，移至盛有1ml無菌鹽水的試管中，使菌液呈輕度混濁，37℃恒溫箱中靜置10分鐘。用記號筆在潔凈的玻片上劃分3個相等的區域，吸取少量菌液滴在玻片第一個小區的一端，立即傾斜玻片，使菌液緩慢地流向另一端，用吸水紙吸去多余的菌液，自然干燥。
（3）染色：加染色液于第一區，使染料覆蓋涂片。隔數分鐘后再將染料加入第二區，依此類推，其目的是確定最合適的染色時間，而且節約材料。
（4）水洗：在沒有傾去染料的情況下，就用蒸餾水輕輕地沖去染料，否則會增加背景的沉淀。
（5）干燥：自然干燥。
（6）鏡檢：先低倍觀察，再高倍觀察，最后再用油鏡觀察。
2.芽孢染色法
（1）制備菌液：加1～2滴無菌鹽水于小試管中，用接種環從斜面上挑取2～3環的枯草芽孢桿菌于試管中并充分混勻。
（2）加染色液：加5%孔雀綠水溶液2～3滴于小試管中，用接種環攪拌使染料與菌液充分混合。
（3）加熱：沸水浴15～20分鐘。
（4）涂片：用接種環從試管底部挑2環菌液，涂片并晾干。
（5）固定：將涂片來回通過酒精燈火焰3次。
（6）脫色：用水洗直至流出的水中無孔雀綠顏色為止。
（7）復染：加蕃紅水溶液染色5分鐘后，傾去染色液，不用水洗，直接用吸水紙吸干后鏡檢。
3.莢膜染色法
（1）涂片：按常規方法將肺炎鏈球菌制成一薄的涂片，自然干燥，加熱固定。
（2）染色：滴加結晶紫染液1分鐘。
（3）脫色：用20%CuSO4溶液洗去結晶紫，勿水洗，直接用吸水紙吸干后鏡檢。
【實驗結果】
變形桿菌菌體和鞭毛均染成紅色結果；枯草芽孢桿菌芽孢呈綠色，芽孢囊和菌體為紅色；在藍紫色背景下，肺炎鏈球菌菌體呈紫色，莢膜無色或淺紫色。
【注意事項】
1.細菌鞭毛極細，很容易脫落，操作時必須小心謹慎。
2.供芽孢染色用的菌種應控制菌齡。
3.因莢膜為可溶性物質，故染色沖洗時動作要輕柔，防止脫離。
【思考題】
1.為什么用油鏡要等標本完全干后才能滴加香柏油？
2.如果顯微鏡視野光線太強或者太弱，應該怎么調節？
3.細菌涂片過厚對革蘭染色有什么影響？
4.革蘭染色后，如果金黃色葡萄球菌被染成紅色，可能是什么原因造成？
5.細菌不染色標本的檢查有什么實際意義？
6.細菌特殊染色標本的檢查有什么實際意義？
（夏乾峰）