1. 前 言
1.1 GPCR在信號轉導和藥物發現中的重要性
由磷脂雙分子層組成的細胞膜將細胞內部物質從周圍環境中獨立出來，使細胞可以
在一個相對封閉的環境開展自主的生命活動。細胞內外并非完全隔絕，一方面，細胞膜
把相對有害的物質隔絕在周圍環境中；另一方面，細胞需要和外界進行物質交換，并感
知外界的環境刺激，因應外界的刺激做出合適的響應。因此，細胞的跨膜信號轉導在細
胞的生命活動中有重要的作用。而特征拓撲結構為7次跨膜螺旋的G蛋白偶聯受體
（GPCR），在人類基因組中擁有800多個成員，是細胞膜蛋白中的最大家族，在細胞的
跨膜信號轉導過程中占據核心的位置（圖1）（Fredriksson et al., 2003）。
正是因為GPCR在跨膜信號轉導中的重要性，它一直以來都是藥物發現的研究熱
點。目前，約40%的臨床處方藥是直接或間接作用在GPCR或其介導的信號通路上的
（Wise et al., 2002; Katritch et al., 2012）。而對GPCR介導的信號轉導機制的研究和藥物
與GPCR相互作用機理的研究，因也引領了20世紀藥物學的發展（肖鵬等，2012）。以
GPCR作為靶點的藥物可應用于治療涵蓋了人類的多種疾病，如治療心臟病的藥物心得
安、治療胃潰瘍的藥物西米替丁，以及最近成功用于糖尿病的藥物利拉魯肽（Black et al.,
1964; Guth et al., 1979; Buse et al., 2009）。
圖1 G蛋白偶聯受體介導的跨膜信號轉導（修改自Rosenbaum et al., 2009）
以腎上腺素能受體激活為例，G蛋白偶聯受體（GPCR）所介導的多個信號通路。β2腎上腺素能受體可以分別激
活Gs和Gi兩種蛋白。Gs蛋白激活后，增加腺苷酸環化酶活性，提高細胞內第二信使cAMP濃度，升高蛋白激酶
A （PKA）的活性。蛋白激酶A在體內調控L型鈣離子通道活力并負反饋調控β2腎上腺素能受體的活性。β2腎
上腺素能受體在激活過程中的構象變化激活G蛋白偶聯受體激酶（GRK）。GRK催化受體磷酸化進而推動Arrestin
與受體結合。Arrestin一方面與Clathrin和AP-1相互作用從而介導受體的內吞,阻礙G蛋白結合而終止G蛋白信號；
另一方面Arrestin也可激活胞外信號調節激酶（ERK）等非G蛋白依賴的信號轉導途徑，獨立介導GPCR下游的
信號轉導
1.2 GPCR研究領域的發展歷史及最近的突破
從20世紀初 John N. Langley（英國）提出受體的概念開始，關于受體的研究已經
持續了130余年。最初，Langley的學生Archibald V. Hill（英國）用數學方程描述了受
體與配體作用的二元模型。此后的50多年，受體的研究主要由化學家和生理學家共同
推進。分子生物學家是在20世紀70年代開始加入對受體的研究的，延續至今并不斷獲
得突破。由于Robert J. Lefkowitz（美國）和Brian K. Kobilka（美國）過去40年中在
GPCR分子機制中的奠基性貢獻，包括腎上腺素能受體的同位素標記、純化和克隆，配
體-受體-效應器三級復合物模型等，以及Kobilka近些年來在GPCR結構研究方面的突
破，這兩位科學家于2012年獲得諾貝爾化學獎（肖鵬等, 2012）。到目前為止，GPCR
涉及的領域已經獲得了10次諾貝爾獎，彰顯了GPCR研究的重要性。
雖然GPCR如此重要，但可為GPCR的機制研究奠定基礎的GPCR結構生物學研
究卻一直進展緩慢，主要原因是除視桿色素（rhodopsin）外，大部分GPCR蛋白的表達
豐度都很低，結構不穩定，純化過程中蛋白的失活十分迅速。雖然牛視桿色素的晶體結
構于2000年獲得了解析，但人們長時間對其他GPCR，尤其是結合可擴散配體的GPCR
的結構解析一直束手無策；GPCR與下游效應器復合物的作用機制也很難在原子分辨率
水平的結構上進行闡述。發展一種可對所有GPCR結構解析的方法，成為GPCR研究和
藥物學發展的迫切需求。從Lefkowitz實驗室離開并獨立開展研究工作后，Kobilka進一
步發展了在GPCR第三個內環插入溶菌酶的方法；結合特異性抗體的應用，并與
Raymond C. Stevens（美國）合作，加入了脂立方結晶技術，終于為所有GPCR的結構
解析開拓了一條道路，帶來了這幾年GPCR結構生物學突破性的進展。本文將重點介紹
GPCR結構生物學的進展和目前的研究熱點。
2. GPCR的結構研究進展
2.1 GPCR的研究初期：發現、初步純化和克隆
早在受體的概念提出之前，作為GPCR超家族成員之一的視桿色素就已經在19世
紀70年代被人們發現。視桿色素在視網膜中大量表達，相對其他GPCR較易獲得和純
化。George Wald（美國）從視桿色素中分離了視黃醛，并因此獲得了1967年諾貝爾生
理學或醫學獎；但直到20世紀80年代前，從來沒有人把感光系統與體內激素的生理作
用聯系起來（Palczewski, 2006）。受體的概念由英國藥學家John Langley在20世紀初提
出。Langley在研究膽堿能藥物和箭毒對骨骼肌和唾液腺作用的機制時，首次明確提出
了“感受物質”（receptive substance）這一概念。他推測“感受物質”可以通過某種獨
特的方法與化學物質或神經刺激相結合，并且可以引起“主要物質”（chief substance）
功能的改變（Langley, 1905）。該”受體-效應物”理論的提出在當時并未獲得廣泛的認可，
反而受到不少質疑（Lefkowitz, 2013）。盡管如此，配體和受體互作理論在1920~1970年
這半個世紀之間在Henry H. Dale（英國）、Alfred J. Clark（英國）、John H. Gaddum（英
國）、Robert P. Stephenson（英國）、Raymond P. Alquist（美國）、Everhardus J. Ari?ns（荷
蘭）、James W. Black（蘇格蘭）、Robert F. Furchgott（美國）和Heinz O. Schild（英國）
等人的努力下得到了充分的發展。20世紀60年代是GPCR研究歷史上的一個重要時期，
Earl W. Sutherland（美國）對腺苷酸環化酶及其產物“第二信使”——cAMP的研究顯
示，cAMP介導激素引起的細胞響應，很大程度上暗示了受體是物理存在的，而不僅僅
是一個概念。然而受體本身是什么物質，依然是一團疑云，充滿爭議。諾貝爾獎得主
Sutherland就曾一度認為腺苷酸環化酶本身就是受體（Robison et al., 1967）。當時在哥倫
比亞大學醫學院做住院醫生的Lefkowitz在這時加入到發現受體的研究當中（Snyderman,
2011）。Lefkowitz應用放射性同位素125I和3H分別標記了促腎上腺皮質激素（ACTH）
和去甲腎上腺素（NA），從而發現在細胞表面上存在可與激素結合的受體（Lefkowitz et
al., 1970; Lefkowitz and Haber, 1971），而且激素與受體的結合與腺苷酸環化酶的激活是
兩個獨立的過程（Lefkowitz et al., 1970）。
雖然同位素標記實驗證明了配體（激素）可以直接與膜上的蛋白質選擇特異性的相
互作用，但這些與配體相互作用的膜蛋白是否就是傳遞配體信號的物質，還需要進一步
證實。分離純化并獲得高純度的受體，對受體進行性質鑒定和功能分析是證明受體客觀
存在的最好證據。然而由于大部分GPCR在細胞內的豐度極低，其純化需要至少100 000
倍的富集，又因其內部結構的不穩定性，而非常易于失活，因此早期GPCR的純化工作
十分困難（Lefkowitz, 2013）。Lefkowitz在早期純化β2腎上腺素能受體蛋白時，嘗試了
多種方法。他的研究組發現，去污劑Lubrol-PX和deoxycholate的應用可顯著提高β2
腎上腺素能受體蛋白的可溶性。針對GPCR蛋白的低豐度和與配體特異性的結合這些性
質，Lefkowitz課題組制作了親和層析柱，在瓊脂糖的側鏈上人工加入長度為30?的糖
鏈，并在鏈的末端與去甲腎上腺素偶聯。這些方法的聯合使用，使他們獲得了較純的β2
腎上腺素能受體蛋白，純度提高了500~800倍（Lefkowitz et al., 1972）。該方法的成功
為純化其他擴散性配體GPCR拓寬了道路。Lefkowitz課題組進一步應用腎上腺素能受體
的拮抗劑alprenolol偶聯的瓊脂糖作為親和層析柱的介質，解決了去甲腎上腺素易氧化
的問題，建立了更有效的適合大規模純化受體蛋白的方法（Caron et al., 1979）。隨后，
除β2腎上腺素能受體外，當時已知的β1、α2和α1腎上腺素能受體同樣被成功純化。對
純化后的受體研究表明，上述腎上腺素能受體均為高度疏水的糖蛋白單體，分別識別特
異的擴散性配體（Caron et al., 1979; Regan et al., 1982; Shorr et al., 1982; Benovic et al.,
1984; Lomasney et al., 1986; Repaske et al., 1987）。GPCR 純化方法的初步建立為其下一
步的分子克隆和結構解析奠定了基礎。
因在視網膜中的高豐度表達和結構的穩定性，GPCR家族成員中的視桿色素的相
關研究一直走在其他GPCR研究的前面。然而，在Lefkowitz和Kobilka推斷腎上腺素
能受體和視桿色素同屬于GPCR超家族之前，沒有人將二者緊密的聯系到一起。依據視
桿色素蛋白測序的結果，在1983年和1984年，牛和人視桿色素蛋白編碼基因被成功克
隆（Nathans and Hogness, 1983; Nathans and Hogness, 1984）。序列分析顯示視桿色素蛋
白與古細菌Halobacterium halobium中感光的質子傳遞蛋白bacteriorhodopsin均具有7
次跨膜區域（Henderson and Unwin, 1975; Ovchinnikov, 1982; Hargrave et al., 1983）。因此，
7次跨膜結構一開始被認為是感光蛋白的特征結構，而沒有人把7次跨膜與激素受體關
聯起來。基于Lefkowitz研究組純化的β2腎上腺素能受體蛋白的序列分析結果，以及
Kobilka大膽的應用基因組DNA進行克隆的方法，1986年，第一個擴散性配體的受體
編碼基因被成功克隆（Dixon et al., 1986）。對編碼基因序列的分析發現，β2腎上腺素能
受體具有7個富含脯氨酸和芳香族氨基酸的疏水跨膜區域，蛋白N端含有多個糖基化位
點而C端具有多個磷酸化位點（Dixon et al., 1986），這些結構特點與視桿色素蛋白結構
類似。更重要的是，二者均通過與G蛋白偶聯發揮功能（Gilman, 1984; Stryer, 1986）。
Lefkowitz和Kobilka據此提出了具有7次跨膜結構的G蛋白偶聯受體家族的概念
（Dohlman et al., 1987）。此后的短時間內，包括人類β1、β2、血小板α2在內的腎上腺素
能受體和毒蕈鹼乙酰膽堿受體（muscarinic acethylcholine receptor）等一系列受體編碼基
因或cDNA被成功克隆（Kubo et al., 1986; Frielle et al., 1987; Kobilka et al., 1987; Kobilka
et al., 1987; Fargin et al., 1988; Buck and Axel, 1991）。7次跨膜的GPCR家族的概念也帶
來首個“孤兒受體”的發現（Kobilka et al., 1987）。這個孤兒受體隨后被證實為５羥色胺
（5HTA1A）受體（Fargin et al., 1988），成為首個“脫孤”受體（肖鵬等, 2012）。
隨著人類基因組計劃的開展和完成，我們發現人類GPCR超家族包含超過800個成
員。系統進化分析確定G蛋白偶聯受體可分為5大類：類視桿色素受體亞家族、類Secretin
受體亞家族、Adhesion受體亞家族、Glutamate受體亞家族和Frizzled/Taste2受體亞家族
（Fredriksson et al., 2003）。類視桿色素亞家族成員眾多，約占已知GPCR的80%以上，
是目前研究比較集中的一類。現代分子生物學技術可以使大部分GPCR獲得外源性的過
表達，結合組合化學方法，許多配體與GPCR的相互作用也得到深入的研究。然而，由
于膜蛋白純化和結晶的技術瓶頸，GPCR的結構生物學研究進展一直相對緩慢，為基于
GPCR進行藥物設計和闡明GPCR的工作機制帶來很大障礙，直到Kobilka和Stevens
近年取得開創性的突破。
2.2 GPCR結晶學發展以及技術突破
作為重要的細胞跨膜信號轉導分子，人們一直試圖了解GPCR將細胞外信號傳遞至
細胞內部的作用機制，這就必然需要獲得GPCR與上下游分子相互作用的結構信息。蛋
白質晶體結構可以提供原子層級的高分辨率結構信息，從而回答配體與受體是如何結合
的、配體如何誘導受體產生特異性的構象并傳遞到下游信號分子、受體的構象改變又如
何決定下游信號分子的構象等問題。這些信息對人類科學和藥物發展具有重大價值。除
視桿色素之外，幾乎所有的GPCR家族成員在細胞內的表達豐度都很低，易被降解而失
活；GPCR成員為膜蛋白，具有復雜柔韌的跨膜疏水性結構，所以不易結晶；GPCR構
象始終處于不斷變化的過程中，十分不穩定；這些特點成為制約GPCR家族成員結晶的
主要因素（Lefkowitz et al., 2008）。因此解析GPCR家族成員高分辨率的晶體結構一度
成為在結構生物學和藥物學研究中的重大挑戰，在很大程度上限制了我們對GPCR功能
的研究，阻礙了新藥的開發，直到最近獲得突破。
視桿色素和β2腎上腺素能受體（β2-adrenergic receptor）是兩個被研究得最多的
GPCR。因為視桿色素的高表達豐度，GPCR早期的結構生物學研究主要集中于視桿色
素。在分離的視桿細胞外段中，90%的蛋白質都是視桿色素。純化后的視桿色素在避光
條件下及溫和的去污劑中可長期保持穩定，穩定性達數周之久。所以不需要復雜的純化
技術和外源性的重組蛋白表達，人們可以非常容易的獲得足夠的視桿色素蛋白進行結構
生物學分析。在編碼視桿色素的基因被克隆之前，人們在1975年就觀察到細菌感光的
質子傳遞蛋白bacteriorhodopsin的電鏡圖像（Henderson and Unwin, 1975），在1982年就
已經獲得了牛視桿色素的晶體（Corless et al., 1982）。即使這樣，視桿色素的結構分析的
進展也比較緩慢。在獲得二維晶體結構十多年后，Gebhard F. X. Shertler（奧地利）和
Paul A. Hargrave（美國）等才用電鏡的手段獲知視桿色素7次跨膜區域的排布模式和方
向（Schertler et al., 1993; Unger and Schertler, 1995; Unger et al., 1997）。2000年，Krzysztof
Palczewski（波蘭）等在嘗試多種去污劑后，利用octyl-β-glucoside和heptanetriol成功輔
助結晶了牛視桿色素蛋白，并通過X射線衍射解析獲得了第一個GPCR的晶體結構，
分辨率為2.8?（Palczewski et al., 2000）。2004年，去污劑n-octyltetraoxyethylene（Li et al.,
2004）、heptylthioglucoside（Okada et al., 2004）的應用使牛視桿色素蛋白晶體結構分辨
率提高到了2.2?。在這一時期內，牛視桿色素蛋白是唯一獲得原子層級的高分辨率結構
的GPCR家族成員（Palczewski et al., 2000; Teller et al., 2001; Okada et al., 2002; Li et al.,
2004; Okada et al., 2004）。
