合成生物學基礎實驗原理與技術：大腸桿菌篇（簡體書）

牛福星，副教授，2015.9-2018.7博士畢業於中山大學，2018.8-2021.8於中山大學繼續從事博士後科研工作，主要從事合成生物學方向研究。目前主持在研國家自然科學基金地區項目1項（33萬），中央引導地方科技發展專項1項（50萬），廣西科技計劃項目1項（10萬），廣西科技大學3331人才項目1項（100萬）。近五年主持完成省部級資金來源項目3項，參與國家重點研發項目1項（341萬）。目前擔任廣西科技大學生化學院生工系主任、廣西科技評審專家，廣西科協智庫專家；廣西微生物學會理事等職務；同時為Journal of Agricultural and Food Chemistry、Frontiersin Microbiology、Scientific Reports、Frontiers in Bioengineering and Biotechnology等國際期刊審稿工作。目前主講本科基因工程實驗課程，發酵工程、生物分離工程專業必修課程，以及研究生代謝控制發酵、微生物工藝實驗課程。

合成生物學以其“造物致知、造物致用”的理念快速發展，已經廣泛應用於生物醫藥、新材料、農業、食品、環境保護等領域。目前世界上有超過60%的化學品可以被用於生物合成，掌握合成生物學技術精華是目前生物領域學者的必修課。本書從實驗設計上對於初學者迅速入門具有巨大助益，同時有助於提高開設本門相關課程實驗員及任課老師上課效率。

合成生物學是按照一定的規律和已有的知識，設計和建造新的生物零件、裝置和系統，或重新設計已有的天然生物系統來為人類特殊目的服務的學科。
合成生物學取代傳統生產方式的關鍵在於成本和效率。通過不斷的科學研究和探索積累，科研人員發展了一系列高效的合成生物技術，以通過賦予生物體新的功能來達到特定目標。自1953 年Crick、Watson 發現DNA 雙螺旋結構及半保留復制開始，人們才逐漸開始認識到生物系統是可調控的。生物進行產物合成的基礎在於其體內的代謝網絡，代謝網絡的運行需要借助各種酶的參與，所以生物反應過程的本質即為酶的催化。按照“中心法則”，經過基因的轉錄、翻譯及折疊，形成具有不同構象的酶，從而催化不同底物。不同功能酶的催化可以產生不同種類和數量的微生物代謝產物。科研工作者們借助強大的底盤細胞進行異源功能酶的大量、高效表達，從而實現非本源物質的合成，造就了合成生物學的快速發展。據不完全統計，目前世界上60% 的化合物可以通過生物合成實現。
生物合成關鍵在於有一個好的“思路”，而實現該目標的基礎在於具備良好的實驗操作技能。本書就目前實驗室常用模式菌株大腸桿菌（Escherichia coli）的合成生物學基礎實驗進行系統性的歸納及總結。前後實驗環環相扣，前一節的知識及實驗成果為下一節實驗做準備，實現連貫性操作。採用本書進行教學的工作人員不僅可以清晰地了解所需要準備的材料和設備，還可以通過本書所設計的實驗流程，減少重復工作。
每節中列出主要使用的實驗材料、試劑與設備。學生們通過本書的學習，可以掌握合成生物學基礎實驗技能。本書融入了大量科研實驗技術和經驗（已經被驗證並發表），相比於傳統的分子生物學技術更加高效。每節設置了實驗注意事項及思考題，促進學生們更深入地了解相關實驗。
本書的主要編者均是長期在生物科研一線工作的教師。本書編寫過程中得到了中山大學劉建忠教授、華南理工大學黃明濤教授、廣西大學韋宇拓教授以及廣西科技大學伍時華教授的指導及指正，在此對他們表示衷心的感謝。
本書由廣西科技大學教材建設基金、國家自然科學基金（No.32260246）、中央引導地方科技發展專項基金（No. 22096007）、廣西科技計劃項目基金（No. AD22080011）資助出版，在此表示感謝。
盡管每位編者都細心努力地對本書進行審校及修正，但也難免出現不足之處，誠望各位讀者批評指正。

編者
2024年9月

第一章　感受態細胞的快速制備及轉化 001
第一節　感受態細胞的化學法快速制備 003
一、實驗目的 003
二、實驗原理 003
三、實驗材料、試劑與設備 004
四、實驗流程 004
五、注意事項 005
六、思考題 005
第二節　利用熱激法制備的感受態細胞進行轉化 006
一、實驗目的 006
二、實驗原理 006
三、實驗材料、試劑與設備 007
四、實驗流程 007
五、注意事項 007
六、思考題 008
第三節　感受態細胞的電轉化法快速制備 009
一、實驗目的 009
二、實驗原理 009
三、實驗材料、試劑與設備 009
四、實驗流程 010
五、注意事項 010
六、思考題 011
第四節　利用電轉化法制備的感受態細胞進行轉化 012
一、實驗目的 012
二、實驗原理 012
三、實驗材料、試劑與設備 013
四、實驗流程 013
五、注意事項 013
六、思考題 014

第二章　PCR 擴增及瓊脂糖凝膠核酸電泳技術 015
第一節　常規PCR 技術 017
一、實驗目的 017
二、實驗原理 017
三、實驗材料、試劑與設備 017
四、實驗流程 019
五、注意事項 019
六、思考題 020
第二節　重疊延伸PCR 技術 021
一、實驗目的 021
二、實驗原理 021
三、實驗材料、試劑與設備 021
四、實驗流程 023
五、注意事項 023
六、思考題 024
第三節　定點突變PCR 技術 025
一、實驗目的 025
二、實驗原理 025
三、實驗材料、試劑與設備 025
四、實驗流程 026
五、注意事項 027
六、思考題 028
第四節　瓊脂糖凝膠核酸電泳技術 029
一、實驗目的 029
二、實驗原理 029
三、實驗材料、試劑與設備 029
四、實驗流程 030
五、注意事項 031
六、思考題 032

第三章　DNA 提取 033
第一節　大腸桿菌基因組的提取（機械破胞 柱法回收） 035
一、實驗目的 035
二、實驗原理 035
三、實驗材料、試劑與設備 036
四、實驗流程 036
五、注意事項 037
六、思考題 037
第二節　質粒提取（堿裂解 柱回收法） 038
一、實驗目的 038
二、實驗原理 038
三、實驗材料、試劑與設備 039
四、實驗流程 039
五、注意事項 040
六、思考題 041
第三節　PCR 產物回收（乙醇沉澱法） 042
一、實驗目的 042
二、實驗原理 042
三、實驗材料、試劑與設備 042
四、實驗流程 043
五、注意事項 043
六、思考題 043
第四節　PCR 產物/ 酶切產物純化（柱提法） 044
一、實驗目的 044
二、實驗原理 044
三、實驗材料、試劑與設備 044
四、實驗流程 045
五、注意事項 046
六、思考題 046

第四章　工具酶的使用以及載體構建 047
第一節　限制性核酸酶（DpnⅠ）的使用 050
一、實驗目的 050
二、實驗原理 050
三、實驗材料、試劑與設備 050
四、實驗流程 051
五、注意事項 051
六、思考題 052
第二節　限制性核酸內切酶的使用 053
一、實驗目的 053
二、實驗原理 053
三、實驗材料、試劑與設備 053
四、實驗流程 054
五、注意事項 055
六、思考題 055
第三節　連接酶的使用 056
一、實驗目的 056
二、實驗原理 056
三、實驗材料、試劑與設備 056
四、實驗流程 057
五、注意事項 057
六、思考題 059
第四節　T 載體構建 060
一、實驗目的 060
二、實驗原理 060
三、實驗材料、試劑與設備 061
四、實驗流程 061
五、注意事項 062
六、思考題 062

第五章　陽性轉化子的篩選與鑒定 063
第一節　菌落PCR 鑒定 065
一、實驗目的 065
二、實驗原理 065
三、實驗材料、試劑與設備 065
四、實驗流程 066
五、注意事項 067
六、思考題 067
第二節　基於藍白斑篩選的載體構建 068
一、實驗目的 068
二、實驗原理 068
三、實驗材料、試劑與設備 068
四、實驗流程 069
五、注意事項 070
六、思考題 070
第三節　基於熒光蛋白報告基因的載體構建和鑒定 071
一、實驗目的 071
二、實驗原理 071
三、實驗材料、試劑與設備 071
四、實驗流程 072
五、注意事項 072
六、思考題 073
第四節　選取載體的重鑒定 074
一、實驗目的 074
二、實驗原理 074
三、實驗材料、試劑與設備 074
四、實驗流程 075
五、注意事項 076
六、思考題 076

第六章　蛋白質表達純化及鑒定 077
第一節　蛋白質表達 079
一、實驗目的 079
二、實驗原理 079
三、實驗材料、試劑與設備 079
四、實驗流程 080
五、注意事項 080
六、思考題 081
第二節　細胞收集與破碎 082
一、實驗目的 082
二、實驗原理 082
三、實驗材料、試劑與設備 082
四、實驗流程 083
五、注意事項 084
六、思考題 084
第三節　蛋白質純化 085
一、實驗目的 085
二、實驗原理 085
三、實驗材料、試劑與設備 085
四、實驗流程 086
五、注意事項 087
六、思考題 088
第四節　SDS-PAGE 電泳 089
一、實驗目的 089
二、實驗原理 089
三、實驗材料、試劑與設備 089
四、實驗流程 091
五、注意事項 092
六、思考題 093

第七章　CRISPR 技術應用 095
第一節　CRISPR 基因敲除 097
一、實驗目的 097
二、實驗原理 097
三、實驗材料、試劑與設備 097
四、實驗流程 100
五、注意事項 102
六、思考題 103
第二節　CRISPR 基因敲除驗證及質粒去除 104
一、實驗目的 104
二、實驗原理 104
三、實驗材料、試劑與設備 104
四、實驗流程 105
五、注意事項 106
六、思考題 107
第三節　CRISPR 基因抑制 108
一、實驗目的 108
二、實驗原理 108
三、實驗材料、試劑與設備 108
四、實驗流程 109
五、注意事項 110
六、思考題 110
第四節　CRISPR 基因激活 111
一、實驗目的 111
二、實驗原理 111
三、實驗材料、試劑與設備 112
四、實驗流程 112
五、注意事項 113
六、思考題 114

附錄一　常用培養基配方 115

附錄二　常用限制性內切酶 119

附錄三　思考題參考答案 123

參考文獻 139