微生物學實驗（簡體書）

楊民和主編的《微生物學實驗》內容介紹：本書共分8章61個實驗，包括：微生物的形態觀察、分離和純培養、生長和數量的測定、生理生化反應、遺傳與育種、血清學鑒定、分子微生物學和應用微生物學等。每個實驗列出實驗原理、目的要求、實驗器材、方法和步驟、結果與分析、注意事項和思考題等內容。書后有附錄和參考資料。

微生物學作為一門學科，起源於人類長期的生產實踐，對於與釀造工業、醫學、農業和人類日常生活相關的微生物學問題的關注，特別是顯微鏡和純培養技術的發明與使用，是微生物學創立的基礎。因此，微生物學是一門實踐性非常強的學科，微生物學的實驗操作技術是該學科的重要組成部分。隨著科學的發展，微生物學實驗技術積極地向其他學科廣泛滲透，為遺傳學、生物化學、分子生物學和生物技術等現代學科的發展做出了重要的貢獻。生命科學類專業的學生只有在學習微生物學基本理論的基礎上，全面、系統地學習、掌握和實踐微生物學相關的實驗操作技能，才能更好地學習和理解其他學科的知識，並將生物學理論和技術應用到科學研究與生產實際中去。
在當前的師範院校中，既有像生物科學這樣的師範類專業，又有像生物技術、生物工程和發酵工程一類的非師範專業。在師範院校的課程設置中，微生物學是一門專業基礎課，但各個專業在對微生物學教學內容的要求上不盡相同。因此，在實驗內容的選擇上，本書偏重於基礎實驗技術，強化微生物學的基本實驗技能，力求訓練和提高學生實際應用微生物學理論與技術的能力。同時，為適應新形勢的要求，培養學生的綜合素質和創新能力，本書也安排了分子微生物學和應用微生物學的實驗內容。各單位可以根據自己的實際條件和教學要求，選做相應的實驗內容，並可以將相關的實驗綜合起來，組織研究型實驗內容。
本書共分8章61個實驗，包括：微生物的形態觀察、分離和純培養、生長和數量的測定、生理生化反應、遺傳與育種、血清學鑑定、分子微生物學和應用微生物學等。每個實驗列出實驗原理、目的要求、實驗器材、方法和步驟、結果與分析、注意事項和思考題等內容。書後有附錄和參考資料。
2008年，福建師範大學生命科學學院獲批建設“國家級生物學實驗教學示範中心”，《微生物學實驗》作為國家級實驗教學示範中心的配套教材之一，一直得到張彥定教授和陳寅山教授的鼓勵與幫助；參編單位給予了積極的協作和配合，科學出版社給予了大力的支持。在此，謹向以上單位和個人表示衷心的感謝！
參與本書編寫的成員來自福建、江西兩省的部分師範院校，均為微生物學教學和科研的第一線骨干教師。本書的編寫，既有我們教學和科研經驗的總結，也參考了國內兄弟院校編寫的實驗教材。鑑於我們的業務水平有限，真誠地希望老師和同學們在使用的過程中，對書中的不足之處加以指正。

前言
第一章 微生物的個體形態觀察
實驗1 細菌的簡單染色及形態觀察
實驗2 細菌的革蘭氏染色法
實驗3 細菌的芽孢染色
實驗4 細菌的鞭毛染色及運動性觀察
實驗5 放線菌的形態觀察
實驗6 霉菌水浸玻片的制備和觀察
實驗7 霉菌分生孢子的培養和觀察
實驗8 酵母菌子囊孢子的培養和觀察
實驗9 傘菌菌絲體、子實體和孢子的形態觀察
實驗10 噬菌斑的培養和觀察

第二章 微生物的分離和純培養
實驗11 玻璃器皿的洗滌和滅菌
實驗12 無菌操作和微生物的接種技術
實驗13 牛肉膏蛋白胨培養基的配制
實驗14 馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基的配制
實驗15 高氏Ⅰ號培養基的配制
實驗16 血瓊脂培養基的配制
實驗17 培養基的滅菌和消毒
實驗18 土壤中微生物的分離和純化
實驗19 植物組織中微生物的分離和純化
實驗20 環境中噬菌體的分離與純化
實驗21 噬菌體效價的測定
實驗22 不同類型微生物培養特征的比較
實驗23 微生物的液體搖瓶培養
實驗24 微生物菌種保藏

第三章 微生物的生長和數量的測定
實驗25 微生物的顯微計數法
實驗26 光電比濁計數法
實驗27 稀釋平板菌落計數法
實驗28 微生物生長曲線的測定
實驗29 微生物細胞大小的測定
實驗30 環境因素對微生物生長的影響

第四章 微生物的生理生化反應
實驗31 大分子物質的水解實驗
實驗32 糖發酵實驗
實驗33 IMViC和硫化氫實驗

第五章 微生物的遺傳與育種
實驗34 微生物的紫外線誘發突變
實驗35 抗藥性突變株的分離
實驗36 營養缺陷型菌株的篩選和鑒定
實驗37 霉菌原生質體的制備和觀察
實驗38 霉菌原生質體的融合

第六章 細菌的血清學鑒定
實驗39 免疫血清的制備
實驗40 直接凝集反應
實驗41 沉淀反應
實驗42 雙向免疫擴散試驗

第七章 分子微生物學基礎
實驗43 細菌質粒DNA的小量制備
實驗44 感受態細胞的制備
實驗45 質粒DNA的轉化
實驗46 DNA重組
實驗47 土壤中總DNA的提取
實驗48 PCR技術

第八章 應用微生物學實驗
實驗49 水中細菌總數的測定
實驗50 多管發酵法測定水中大腸菌群數
實驗51 牛乳中細菌的檢測
實驗52 乳酸發酵和乳酸菌飲料制作
實驗53 乙醇發酵及糯米甜酒的釀制
實驗54 抗生素效價的測定
實驗55 抗生素體外抑菌活性的測定——抗菌譜實驗
實驗56 蘇云金芽孢桿菌的發酵生產
實驗57 食用菌的分離和培養
實驗58 食用菌的固態發酵和栽培
實驗59 脂肪酶產生菌的篩選
實驗60 檢測幾種常見消毒劑的殺菌效果
實驗61 乳酸菌篩選及抑菌作用研究

參考文獻
附錄
附錄Ⅰ 常用的微生物名稱
附錄Ⅱ 常用培養基配方
附錄Ⅲ 常用試劑和溶液的配制
附錄Ⅳ 常用染色液的配制

第一章 微生物的個體形態觀察
實驗1 細菌的簡單染色及形態觀察
【實驗原理】
細菌菌體微小且透明，在光學顯微鏡下，特別是在油鏡下，菌體與背景沒有顯著的明暗差，很難看清菌體形態。若菌體染色，則菌體折光率增大，其形態易于觀察。
細菌染色的染料是一類苯環上含有發色基團和助色基團的化合物。發色基團使化合物具有染色能力；助色基團有電離特性，可以與被染物結合，使被染物著色。染色的染料分為堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。堿性染料帶正電荷，能和帶負電荷的物質結合。因細菌蛋白的等電點較低，當它生長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷，所以通常采用美藍、結晶紫、堿性復紅或孔雀綠等堿性染料使其著色。酸性染料帶負電荷，能與帶正電荷的物質結合。當細菌分解糖類產酸使培養基pH下降時，細菌所帶正電荷增加，易被伊紅、剛果紅或酸性復紅等酸性染料著色。中性染料又稱復合染料，是前兩類染料的結合物，如伊紅美藍、伊紅天青等。
簡單染色法是利用單一染料對細菌進行染色以顯示其形態的一種方法。
該方法操作簡便，適于觀察細菌的一般形狀及排列，但不能辨別細菌細胞的構造。
【實驗目的和要求】
1.了解簡單染色法的基本原理，并掌握其操作方法；
2.掌握油鏡的使用及無菌操作技術；
3.初步認識細菌的形態特征。
【實驗器材】
1.菌種大腸桿菌（Escherichiacoli）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）。
2.染色液堿性美藍染液、結晶紫染液。
3.器材顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環、香柏油、二甲苯、生理鹽水、擦鏡紙等。
【實驗方法與步驟】
簡單染色法的基本程序如下：涂片干燥固定染色水洗干燥鏡檢
1.涂片在干凈的載玻片中央滴加一小滴生理鹽水或用接種環挑3或4環生理鹽水，然后在無菌操作條件下，用接種環從斜面上挑取少量菌種于載玻片上的生理鹽水中，混勻并涂成薄膜，涂布面積為1～1.5cm2。
2.干燥涂片可以放在空氣中自然干燥；若要使干燥速度加快，可在酒精燈上方加溫，但勿緊靠火焰。
3.固定待涂片干燥后，手持涂片一端，有菌膜的一面向上，在酒精燈火焰上通過2或3次，待冷卻后，再加染料。
4.染色將涂片水平放置，在菌膜部位滴加染色液（以恰好覆蓋菌膜為宜），染色1～2min。
5.水洗傾去染液，斜置涂片，用細水流的自來水沖洗（切勿用自來水直接沖洗菌膜部位），直至洗下水呈無色為止。
6.干燥將水洗的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干，注意不要擦撩菌體。
7.鏡檢待涂片干燥后，先用低倍鏡觀察，再用高倍鏡觀察，找出適當的視野后，將高倍鏡轉出，在菌膜部位上加香柏油一滴，然后將油鏡頭浸入油滴中仔細調焦觀察細菌的形態。鏡檢完成后，用擦鏡紙滴加二甲苯1～2滴，擦干凈油鏡鏡頭上殘留的香柏油，保持鏡頭的干凈。
【結果與分析】
繪制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌體形態圖。
【注意事項】
1.涂片時，生理鹽水及菌體不宜過多，涂片要均勻，不宜過厚。
2.水洗時，水流不宜過大、過急，以免涂片薄膜脫落。
3.熱固定時溫度不宜過高（以玻片背面不燙手為宜），否則會改變甚至破壞細胞形態。
【思考題】
1.為什么染色前需要進行菌體固定？
2.為什么固定時只能微加熱？若加熱溫度過高、時間過長，會出現什么問題？
3.為什么要待涂片完全干燥后才能使用油鏡進行觀察?
4.為什么鏡檢完成后必須清除殘留在油鏡鏡頭上的香柏油？
實驗2細菌的革蘭氏染色法
【實驗原理】
革蘭氏染色反應是細菌分類和鑒定的一個重要特征，它是1884年由丹麥醫生C.Gram創立的。革蘭氏染色法（Gramstain）不僅能觀察到細菌的形態，而且還可將細菌分為染色反應呈藍紫色的革蘭氏陽性（G+）菌，染色反應呈紅色的革蘭氏陰性（G?）菌。細菌對于革蘭氏染色的不同反應，是由它們細胞壁的成分和結構不同而造成的。革蘭氏陽性菌的細胞壁主要是由肽聚糖形成的網狀結構組成的，在染色過程中，當用乙醇處理時，由脫水而引起網狀結構中的孔徑變小，通透性降低，使結晶紫-碘復合物被保留在細胞內而不易脫色，因此，呈現藍紫色；革蘭氏陰性菌的細胞壁中肽聚糖含量低，而脂類物質含量高，當用乙醇處理時，脂類物質溶解，細胞壁的通透性增加，使結晶紫-碘復合物易被乙醇抽出而脫色，然后又被染上了復染液（番紅）的顏色，因此呈現紅色。
【實驗目的和要求】
1.了解革蘭氏染色法的原理及其在細菌分類鑒定中的重要性；
2.掌握革蘭氏染色方法。
【實驗器材】
1.菌種培養18～24h的大腸桿菌（Escherichiacoli）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus）、待測菌一種。
2.藥品乙二酸銨結晶紫染液、盧戈氏（Lugol）碘液、95%乙醇、番紅復染液、無菌水。
3.用具載玻片、接種環、鑷子、酒精燈、火柴、洗瓶、廢液缸、吸水紙、顯微鏡等。
【實驗方法與步驟】
1.涂片將培養18～24h的3種菌分別用接種環涂3條帶于清潔載玻片上（注意涂片不宜過厚），風干、固定（通過火焰1或2次即可，不可過熱，以載玻片不燙手為宜）。
2.染色
（1）初染：滴加乙二酸銨結晶紫染液覆蓋涂菌帶，染色1～2min，水洗至洗出液無色。
（2）媒染：滴加盧戈氏碘液沖去殘水，并覆蓋約1.0min，水洗至洗出液無色。
（3）脫色：將載玻片上面的水用吸水紙吸干，在白色背景下滴加95%乙醇洗至洗出液無色時（20～30s），立即用水洗去乙醇，用吸水紙吸干。
（4）復染：用復染劑（番紅）染色10s，水洗。
（5）鏡檢：吸干或風干后，油鏡觀察。
【結果與分析】
實驗結果革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。檢視實驗中3種菌各染成什么顏色？它們是革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽性菌？將實驗結果記錄在表2-1中。
【注意事項】
1.染液要求新配制，放置時間不宜過長，盧戈氏碘液易褪色失效，必須裝在棕色試劑瓶內并放于暗處保存。
2.革蘭氏染色的關鍵在于嚴格掌握95%乙醇脫色程度，如脫色過度，則陽性菌可被誤染為陰性菌；而脫色不夠時，陰性菌可被誤染為陽性菌，因此脫色時間一定要把握好。
3.菌齡也影響染色結果，如陽性菌培養時間過長，或已死亡及部分菌已自行溶解，都常呈陰性反應，因此一定要確保實驗菌的菌齡。
【思考題】
1.革蘭氏染色中涂片為什么不宜過厚？染色成敗的關鍵步驟是哪一步？
2.對未知菌種進行革蘭氏染色時，如何保證染色技術操作正確、結果可靠？
實驗3細菌的芽孢染色
【實驗原理】
芽孢為某些細菌細胞在不良的環境條件下產生的休眠體，芽孢壁厚、透性低、不易著色，而一旦染上顏色以后難以脫色。
芽孢染色主要是利用不同的染料進行染色，使芽孢和營養體呈不同的顏色。
在加熱條件下，用著色力強的染料對芽孢進行染色，菌體也會著色，然后水洗，芽孢染上的顏色難以被洗脫，而菌體會脫色。然后用對比度大的復染劑對菌體染色，菌體染上復染劑顏色，芽孢仍為原來的顏色，因而能更明顯地襯托出芽孢，便于觀察。
【實驗目的和要求】
1.學習并掌握細菌的芽孢染色法；
2.了解并觀察細菌芽孢的結構和形態。
【實驗器材】
1.菌種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、生孢梭菌（Clostridium sporogenes），在適宜的生長溫度下培養20h。
2.藥品5%孔雀綠水溶液、0.5%番紅水溶液、二甲苯、香柏油、蒸餾水、95%乙醇。
3.用具顯微鏡、接種環、酒精燈、載玻片、擦鏡紙、吸水紙等。
【實驗方法與步驟】
1.制片取清潔載玻片，在中央滴一滴蒸餾水，用接種環無菌操作從枯草芽孢桿菌斜面上挑一環菌置于載玻片液滴上，小液滴呈混濁狀即可，并按常規方法干燥、固定（每隔幾秒在酒精燈火焰上過一次）。
2.加熱染色往載玻片滴加數滴5%孔雀綠水溶液覆蓋涂菌部位，用夾子夾住載玻片在微火上加熱至染液冒蒸汽（此時計時）并維持5.0min，加熱時注意補充染液，勿讓涂片干涸。
3.脫色待玻片冷卻后，用緩流自來水沖洗至流出水無色為止。
4.復染用0.5%的番紅水溶液復染1.5～2.0min。
5.水洗用緩流自來水沖洗至流出水無色為止。
6.鏡檢待載玻片自然干燥后（可在酒精燈火焰上每隔幾秒過一次）油鏡鏡檢，觀察芽孢的形態。
【結果與分析】
按表3-1記錄實驗結果。
【注意事項】
1.芽孢染色用的菌種應控制菌齡，幼齡菌尚未形成芽孢，老齡菌芽孢囊破裂。
2.從試管中取菌液時，應先用接種環充分攪拌，然后再挑取菌液，否則菌體沉于管底，涂片時菌體太少。
3.對芽孢進行孔雀綠染色后，一定要等玻片冷卻后方可用水沖洗。
【思考題】
1.芽孢染色法為什么需要加熱？加熱染色時為什么必須維持在染液微冒蒸汽的狀態？
2.脫色反應中，為什么必須用緩流自來水沖洗？
實驗4細菌的鞭毛染色及運動性觀察
【實驗原理】
鞭毛是細菌的運動“器官”，細菌是否具有鞭毛，以及鞭毛著生位置和數目是細菌分類鑒定的重要依據之一。細菌的鞭毛一般都很纖細，其直徑通常為10～20nm，除了很少數能形成鞭毛束（由許多根鞭毛構成）的細菌可以用相差顯微鏡直接觀察到鞭毛束的存在外，細菌的鞭毛一般均不能用光學顯微鏡直接觀察到，而只能用電子顯微鏡觀察。光學顯微鏡觀察細菌鞭毛，必須用鞭毛染色法。
鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染劑處理，使它沉積在鞭毛上，從而使鞭毛直徑加粗，然后再進行染色。常用的媒染劑由單寧酸和氯化高鐵或鉀明礬等配制而成。本實驗主要介紹硝酸銀染色法和改良的Leifson染色法，前一種方法更容易掌握，但染色劑配制后保存期較短。
在顯微鏡下觀察細菌的運動性，可以初步判斷細菌是否具有鞭毛。通常使用壓滴法或懸滴法觀察細菌的運動性。與鞭毛染色法相比，該方法可以較快速、簡便地判斷細菌是否具有鞭毛。觀察時，要適當減弱光強度以增強反差，若光線太強，細菌和周圍的液體難以區分。