分子微生物學實驗指導（簡體書）

本書共包括十四章，包括微生物核酸提取，聚合酶鏈反應，載體連接轉化，大腸桿菌表達，分子雜交，DNA和蛋白質相互作用等目前分子微生物學領域常用的實驗技術，章節順序安排基本參照常規實驗的流程。每個章節在概述部分對實驗原理進行了詳細闡述，便于讀者對實驗步驟的理解；在實驗步驟中，結合前人經驗總結了部分注意事項，可供廣大讀者進行參考；每章結尾均有思考題，可用于實驗的復習和加深理解；書末還附錄有本書所涉及的質粒圖譜及微生物常用培養基配方，可供讀者參考。

柳志強，男。海南大學環境與植物保護學院副教授，研究方向為微生物天然產物分離與應用；植物病害生物防治；微生物功能基因。
李曉宇，女。海南大學環境與植物保護學院副教授，研究方向為分子微生物學；分子植物病理學。

目 錄

第一章 瓊脂糖凝膠電泳
一、實驗材料
二、實驗儀器
三、操作步驟
四、技術要點

第二章 基因組DNA的提取
一、從植物組織提取基因組DNA
二、從動物組織提取基因組DNA
三、細菌基因組DNA的制備
四、絲狀真菌基因組DNA的制備
五、酵母基因組DNA的制備
六、基因組DNA的檢測

第三章 RNA的提取和cDNA合成
一、動植物組織mRNA提取
二、植物病毒RNA提取
三、絲狀真菌RNA提取
四、細菌RNA提取
五、酵母RNA提取
六、cDNA的合成

第四章 聚合酶鏈反應（PCR）
一、常規PCR技術
二、降落PCR
三、RACE技術
四、實時熒光定量PCR

第五章 DNA酶切
一、實驗材料
二、實驗儀器
三、操作步驟
四、技術要點

第六章 重組質粒的連接
一、實驗材料
二、實驗儀器
三、操作步驟
四、技術要點

第七章 大腸桿菌感受態細胞的制備和轉化
一、CaCl2法制備感受態細胞及轉化
二、大腸桿菌超級感受態細胞的制備
三、電轉化感受態細胞的制備及轉化

第八章 質粒DNA的提取
一、實驗材料
二、操作步驟
三、技術要點

第九章 聚丙烯酰胺凝膠電泳
一、實驗材料
二、實驗儀器
三、操作步驟
四、技術要點

第十章 融合蛋白在大腸桿菌中的表達和純化
一、實驗材料
二、實驗儀器
三、操作步驟
四、技術要點

第十一章 分子雜交技術
一、核酸探針標記的方法
二、Southern 雜交
三、Northern 雜交
四、Western 雜交
五、菌落原位雜交
六、斑點雜交
七、雜交反應的條件及參數的優化

第十二章 RFLP和RAPD技術
一、RFLP技術
二、RAPD技術

第十三章 EMSA實驗方案
一、實驗試劑
二、操作步驟

第十四章 酵母雙雜合系統篩選相互作用的蛋白
一、實驗材料與方法
二、陽性克隆的進一步證實
三、注意事項

附錄一 質粒圖譜
附錄二 常用微生物培養基配方

參考文獻

瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的標準方法。該技術操作簡便快速，可以分辨用其他方法（如密度梯度離心法）所無法分離的DNA片段。當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙錠（Ethidium bromide, EB染色），在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶，從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外，還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶，用于以后的克隆操作。
瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離 DNA片度的范圍較廣，不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA 片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恒定的電場下電泳。聚丙烯酰胺分離小片段DNA（5-500bp）效果較好，其分辯力極高，甚至相差1bp的DNA片段就能分開。聚丙烯酰胺凝膠電泳很快，可容納相對大量的DNA，但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進行電泳。目前，一般實驗室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進行DNA電泳。
瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中，在中性pH下帶負電荷的DNA向陽極遷移，其遷移速率由下列多種因素決定：
1. DNA的分子大小
線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子質量對數成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移的越慢。
2. 瓊脂糖濃度
一個特定的線狀DNA分子，其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數與凝膠濃度成線性關系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小，分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%，分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%，DNA片段介于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。
3. DNA分子的構象
DNA分子在電場中移動速度不僅和分子質量有關，還和它本身構象有關。相同分子質量的線狀、開環和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的，超螺旋DNA移動快，而開環DNA移動慢。如在電泳鑒定質粒純度時發現凝膠上有數條DNA帶難以確定是質粒DNA不同構象引起還是因為含有其他DNA引起時，可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收，用同一種限制性內切酶分別水解，然后電泳，如在凝膠上出現相同的DNA圖譜，則為同一種DNA。
4. 電源電壓
在低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子質量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，片段越大，因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達到大，所加電壓不得超過5V/cm。
5. 嵌入染料的存在
熒光染料溴化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA，染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環狀DNA，使其剛性更強，還會使線狀DNA遷移率降低15％。
6. 離子強度影響
電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時（如誤用蒸餾水配制凝膠），電導率小，DNA幾乎不移動，在高離子強度的緩沖液中（如誤加10×電泳緩沖液），則電導很高并明顯產熱，嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。
對于天然的雙鏈DNA，常用的幾種電泳緩沖液有TAE [含EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸] ，TBE（Tris-硼酸和EDTA），TPE（Tris-磷酸和EDTA），一般配制成濃縮母液，儲于室溫。